結(jié)核分枝桿菌ESAT6和CFP10蛋白的表達(dá)、純化及初步應(yīng)用.pdf

1、目的： 本實(shí)驗(yàn)利用基因工程技術(shù)，尋找制備結(jié)核分枝桿菌(MycobacteriumTuberculosis，MTB)6kDa早期分泌性抗原靶(Early secreted antigenic target-6kDa，ESAT6)、培養(yǎng)濾液蛋白10(Culture tilt rate protein 10，CFP10)、CFP10-ESAT6重組蛋白的方法和條件，并研究其免疫活性，為研究此三種蛋白作為臨床診斷試劑或預(yù)防治療藥物打下基

2、礎(chǔ)。 方法： 1.原核表達(dá)載體載體的構(gòu)建：設(shè)計(jì)pET32a(+)-ESAT6、pET32a(+)-CFP10、pET32a(+)-CFP10-ESAT6載體構(gòu)建策略，并運(yùn)用DNAStar生物軟件預(yù)測分析載體基因及重組蛋白的抗原位點(diǎn)。 分別設(shè)計(jì)ESAT6、CFP10引物，從MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組中擴(kuò)增ESAT6、CFP10片段，在ESAT6、CFP10片段間加入linke合成CFP10-ESAT6融合基因；分

3、別定向克隆入pET32a(+)原核表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)中，再經(jīng)PCR、酶切等方法鑒定并測序，篩選陽性重組子。 2.重組ESAT6、CFP10、CFP10-ESAT6蛋白(rESAT6、rCFP10、rCFP10-ESAT6)的表達(dá)與純化分別在不同濃度IPTG、不同時(shí)間、不同溫度條件下對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，優(yōu)化誘導(dǎo)條件，Western-blotting檢測、鎳柱純化目的蛋白。 3.表達(dá)蛋白的免疫活

4、性與初步應(yīng)用 ①將上述3個(gè)重組蛋白分別加弗氏佐劑每隔14d免疫小鼠三次。 ②將rESAT6蛋白和PPD分別體外刺激rESAT6蛋白免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞，MTT法檢測淋巴細(xì)胞增殖水平。 ③rESAT6蛋白作為包被抗原與單抗HYB076-08作方陣滴定，rCFP10、rCFP10-ESAT6兩蛋白的包被量參考rESAT6濃度，三種蛋白都與陰性血清做方陣滴定，確定抗原抗體的最佳工作濃度，間接ELISA法檢測免疫小鼠血清

5、抗體，評(píng)估表達(dá)蛋白的免疫活性。 ④在檢測免疫小鼠血清的ELISA法基礎(chǔ)上，用rESAT6蛋白作為包被抗原與單抗HYB076-08作方陣滴定，PPD組與陽性結(jié)核猴血清作方陣滴定，確定抗原抗體的最佳工作濃度，以PPD為平行參照組，以rESAT6蛋白對(duì)結(jié)核病猴(PPD皮試陽性、X光透視陽性)、健康猴(PPD皮試陰性、X光透視陰性)分別進(jìn)行檢測，以確定rESAT6蛋白ELISA法檢測猴結(jié)核的有效性。 ⑤用上述rESAT6蛋白為抗

6、原ELISA檢測猴血清抗體的方法，以PPD ELISA方法檢測方法為對(duì)照，檢測10只待檢猴血清(同時(shí)設(shè)立陰性、陽性、空白對(duì)照)，檢測結(jié)果與PPD ELISA、PPD皮試對(duì)比分析，初步應(yīng)用于猴結(jié)核的檢測。 結(jié)果 1.DNAstar預(yù)測分析結(jié)果表明外源基因大小正確，讀碼框無移位，重組蛋白的抗原位點(diǎn)未被掩蔽。經(jīng)酶切、PCR、測序鑒定，表明pET32a((+)-ESAT6、pET32a(+)-CFP10、pET32a(+)-CF

7、P10-ESAT6三個(gè)原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。 2.重組目的蛋白的最佳誘導(dǎo)條件為IPTG濃度為1mM，25℃誘導(dǎo)6h，成功獲得rESAT6、rCFP10及rCFP10-ESAT6融合蛋白，可溶性目的蛋白表達(dá)量分別占全菌可溶性總蛋白的35.5％、38.1％、18.7％，分離純化后每g工程菌可獲得的可溶性目的蛋白量達(dá)2.247mg-6.536mg。 3.Western-blotting結(jié)果顯示rESAT6蛋白與ESAT6單抗H

8、YB076-08相互反應(yīng)，在2.5×104左右有一條特異的印記帶。 4.ESAT6蛋白及PPD刺激免疫后小鼠脾淋巴細(xì)胞，rESAT6組脾淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)SI為2.232±0.10，PPD平行組SI為2.283±0.12。 5.三種重組蛋白均能刺激小鼠產(chǎn)生相應(yīng)抗體。其中rCFP10-ESAT6蛋白抗體OD值明顯高于rESAT6和rCFP10組(P<0.05)。 6.初步建立并驗(yàn)證了用rESAT6蛋白作為包被抗原

9、與單抗HYB076-08作方陣滴定ELISA檢測猴血清相應(yīng)抗體方法。用方陣法確定了抗原包被量為100ng/孔，一抗猴血清稀釋度為1:40，標(biāo)記二抗稀釋度為1:5000，以rESAT6蛋白為包被抗原ELISA法檢測結(jié)核病猴和健康猴血清檢測結(jié)果分別為陽性和陰性。 7.以rESAT6初步作為抗原檢測待測猴血清相應(yīng)抗體，結(jié)果10個(gè)樣品中9個(gè)與PPD ELISA檢測、PPD皮試結(jié)果一致，符合率為9/10。 結(jié)論： 1.成功

10、構(gòu)建pET32a(+)-ESAT6、pET32a(+)-CFP10、pET32a(+)-CFP10-ESAT6原核表達(dá)載體，建立較好表達(dá)條件，并大量獲得純化蛋白。 2.以表達(dá)蛋白為抗原刺激正常小鼠，MTT法檢測到免疫后小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，ELISA法檢測免疫小鼠蛋白抗體，表明rESAT6、rCFP10和rCFP10-ESAT6蛋白在細(xì)胞免疫和體液免疫方面均有免疫活性。 3.初步建立并應(yīng)用rESAT6蛋白作為抗原ELISA