嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華菌適體的SELEX篩選.pdf

1、嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中比較常見的兩種致病病原菌，易引起多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物致病或致死，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)對(duì)人也有一定的危害。指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)是一種結(jié)合分離、篩選、PCR的組合技術(shù)，其模擬達(dá)爾文進(jìn)化過程可篩選到與靶目標(biāo)結(jié)合的適配子。本研究的目的就是利用SELEX技術(shù)建立一種快速

2、檢測嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華菌的技術(shù)，為兩種菌的檢測提供了一種新的檢測方法。
　　 本研究利用體外人工合成一段長為78nt，中間隨機(jī)序列為35nt，兩端為固定序列的寡核苷酸文庫，利用已設(shè)計(jì)出的引物，以嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華菌為靶目標(biāo)，利用SELEX法篩選出能分別與嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華菌特異性結(jié)合的適體，并用磁珠富集及地高辛-抗地高辛堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)(ELISA)，對(duì)篩選到的適體進(jìn)行親和力測定，最后一輪的篩選產(chǎn)物克隆測序后

3、分別對(duì)其一級(jí)結(jié)構(gòu)及二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。
　　 1、經(jīng)過12輪篩選，嗜水氣單胞菌的親和力吸光值由第一輪的0.32升到第9輪的0.72，親和力提高了2.25倍，利用DNAstar軟件分析嗜水氣單胞菌的39個(gè)克隆子，按照其與預(yù)期長度是否一致分為兩個(gè)群體，與預(yù)期長度一致的有33條，與預(yù)期長度不一致的只有6條，分析發(fā)現(xiàn)保守序列GGTGG存在于所有的39條序列中。對(duì)其二級(jí)機(jī)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)莖環(huán)結(jié)構(gòu)存在于所有的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，這可能是適配子與配體結(jié)合的

4、構(gòu)象結(jié)構(gòu)。對(duì)嗜水氣單胞菌的39條適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，按照莖環(huán)出現(xiàn)位置的不同可分為7類。在利用39條適配子分別測親和力的基礎(chǔ)上檢測出嗜水氣單胞菌的最佳適配子，并對(duì)嗜水氣單胞菌的最佳適體進(jìn)行了特異性檢測，其與嗜水氣單胞菌的結(jié)合率為0.763，遠(yuǎn)高于與其他幾種菌的結(jié)合率，證明了篩選到的適體對(duì)嗜水氣單胞菌有比較強(qiáng)的特異性。
　　 2、經(jīng)過14輪的篩選后，遲緩愛德華菌的親和力吸光值由第一輪的0.632上升到第十三輪的1.799，用D

5、NASTAR、DNAMAN軟件分析20條遲緩愛德華菌適體的一級(jí)序列與二級(jí)結(jié)構(gòu)，20條適體中有17條與預(yù)期長度一致，其一級(jí)結(jié)構(gòu)主要由GGTGGG、TTTTX、GGAGGX三條保守序列組成。對(duì)遲緩愛德華菌的適配子二級(jí)結(jié)構(gòu)按照莖環(huán)出現(xiàn)的位置分類可分為5類.通過比較分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)原件中環(huán)是結(jié)合位點(diǎn)，而莖則是穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)都是以莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)為主，推測莖環(huán)結(jié)構(gòu)可能是適配子的結(jié)合關(guān)鍵，在二級(jí)結(jié)構(gòu)中同樣存在著一些口袋結(jié)構(gòu)，這可能是適配子

6、的結(jié)合部位。
　　 3、針對(duì)篩選過程中的純化步驟做了一個(gè)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，選擇性純化篩選到的適配子相比每輪都純化得到的適配子，其一級(jí)序列的同源性更高，同源性100%的序列出現(xiàn)的頻率較高。通過二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，每輪純化篩選到的適配子二級(jí)結(jié)構(gòu)按照莖環(huán)出現(xiàn)的位置只有5類，而選擇性純化的適配子則有7類，這說明過多的純化會(huì)導(dǎo)致適配子篩選豐富性大大降低，對(duì)篩選起著弱化作用。
　　 4、篩選到了針對(duì)嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華菌的特異性適配子，并