NDA保護(hù)性單抗的鑒定及其抗原表位分析.pdf

1、新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）的HN和F蛋白可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是NDV的主要保護(hù)性抗原。NDV是于副粘病毒科的一個(gè)成員。新城疫是由新城疫病毒引起的對(duì)禽類危害最大的一種急性傳染病,被國(guó)際獸醫(yī)局列為對(duì)畜禽危害最大的A類傳染病之一。90年代后期，報(bào)道雞群具有高抗體水平情況下也會(huì)發(fā)生新城疫。一些學(xué)者認(rèn)為，新的基因型和亞型的出現(xiàn)是導(dǎo)致免疫雞群出現(xiàn)新城疫的主要原因。因此，新城疫疫苗的研究成為重點(diǎn)。本研究

2、旨從實(shí)驗(yàn)室保存的單克隆抗體中篩選得到具有保護(hù)性單克隆抗體，并進(jìn)一步分析保護(hù)性單克隆抗體的抗原表位，為新城疫疾病機(jī)理的研究和表位疫苗的研究奠定理論基礎(chǔ)。
　　 首先，應(yīng)用間接ELISA方法檢測(cè)了F48E9株新城疫病毒分別與F306株、L27株和H55株單克隆抗體的反應(yīng)效價(jià)。應(yīng)用方陣法將NDV從1.5μg/ml稀釋至0.04 μg/ml，將NDV多抗從1:500稀釋至1:16000，確定了NDV抗原最佳包被濃度為0.37μg/ml和

3、4℃過夜的條件。F306株、L27株和H55株單克隆抗體小鼠腹水均以1:1000開始倍比稀釋，進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)其OD492的值。結(jié)果F306株單克隆抗體為陰性，不與病毒反應(yīng)；而L27株和H55株單克隆抗體與病毒反應(yīng)，效價(jià)分別為1:16000和1:32000。根據(jù)亞類鑒定試劑盒測(cè)得F306株單抗和L27株單抗均為IgG1亞類，H55株單抗為IgG2b亞類。應(yīng)用飽和硫酸銨沉淀法提純上述單克隆抗體。
　　 其次，應(yīng)用細(xì)胞微量中和試驗(yàn)鑒定L

4、27和H55兩株單克隆抗體的中和病毒能力。
　　 方法是接種NDV于BHK-21，計(jì)算病毒液的TCID50 (細(xì)胞半數(shù)致死量)。先將病毒稀釋至工作滴度，再與倍比稀釋的單抗腹水反應(yīng)，最后加入單層BHK-21細(xì)胞，并觀察細(xì)胞病變情況并記錄。根據(jù)細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）按Reed-Muench方法計(jì)算細(xì)胞半數(shù)保護(hù)量（The dose of antiserum protects 50％ of cell challenged,PD50）。結(jié)

5、果只有H55株單克隆抗體具有一定的中和病毒能力，相對(duì)于病毒對(duì)照組，細(xì)胞病變延遲13小時(shí)，PD50為10-3.5；而L27株單克隆抗體沒有保護(hù)性。
　　 最后，分析F306株和H55株單克隆抗體針對(duì)的抗原表位。一是應(yīng)用Western blot檢測(cè)，表明這兩株單抗均不與病毒反應(yīng)呈現(xiàn)條帶，提示這兩株單抗針對(duì)的表位可能為構(gòu)象型表位。二是應(yīng)用噬菌體展示12肽庫(kù)分別篩選H55株和F306株單克隆抗體識(shí)別的抗原表位。經(jīng)過三輪淘選得到的噬菌體克