巨噬細(xì)胞極化與弓形蟲感染相關(guān)性的研究.pdf

1、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）簡稱弓形蟲，它是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，幾乎可感染所有的恒溫動(dòng)物。弓形蟲病是全世界范圍內(nèi)感染最為普遍的人獸共患寄生蟲病之一。弓形蟲的生活史較為復(fù)雜，可寄生宿主眾多，造成確診困難，嚴(yán)重威脅了人類及畜牧業(yè)的發(fā)展。作為機(jī)體抵抗病原的第一道屏障，巨噬細(xì)胞在防御過程中是最容易受到感染的細(xì)胞之一，也是弓形蟲急性感染中在全身散播的主要載體細(xì)胞，同時(shí)也為弓形蟲的繁殖提供了有利場(chǎng)所，而弓形蟲與巨噬細(xì)胞之間相

2、互作用的研究是揭示弓形蟲感染、傳播和致病機(jī)制的重要基礎(chǔ)。同時(shí)巨噬細(xì)胞又是重要的免疫細(xì)胞，弓形蟲感染后對(duì)巨噬細(xì)胞極化產(chǎn)生什么樣的影響，以及巨噬細(xì)胞極化對(duì)弓形蟲增殖有何影響，這個(gè)問題的闡明無疑對(duì)進(jìn)一步防控和治療弓形蟲病提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)以小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，通過用 M-CSF體外誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞后，分別用LPS+IFN-γ和IL-4刺激靜息狀態(tài)的巨噬細(xì)胞向M1型和M2型極化，并通過半定量PCR、western

3、blot和FCM檢測(cè)極化相關(guān)的標(biāo)記分子表達(dá)水平，同時(shí)利用Griess法和精氨酸酶活性試驗(yàn)檢測(cè)iNOS和Arginase-1兩種酶的活性，建立小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞的體外極化模型。結(jié)果顯示，LPS+IFN-γ刺激的巨噬細(xì)胞 M1型相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均顯著上調(diào)表達(dá)，而 IL-4刺激的巨噬細(xì)胞M2相關(guān)基因均顯著高表達(dá)?；跇O化模型的成功建立，一方面研究體外小鼠巨噬細(xì)胞在弓形蟲感染后極化的方向以及參與極化的信號(hào)通路活化狀態(tài)。弓形蟲感染巨

4、噬細(xì)胞后0h、6h、12h、24 h、36 h、48 h收集細(xì)胞和上清，Griess法和精氨酸酶活性試驗(yàn)檢測(cè)iNOS和Arginase-1兩種酶的活性，以及通過real-time PCR、western blot和FCM檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)極化相關(guān)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果表明，弓形蟲感染后巨噬細(xì)胞具有高水平的精氨酸酶活性，而iNOS的酶活性沒有明顯變化，核酸和蛋白水平證明M2型標(biāo)記分子顯著高表達(dá)，而部分M1型標(biāo)記分子只在核酸水平有短暫上調(diào)，蛋

5、白水平?jīng)]有顯著變化。進(jìn)一步通過 western blot分析極化相關(guān)的 JAK-STAT、Akt-mTOR信號(hào)通路的激活狀態(tài)，結(jié)果表明弓形蟲感染后激活了JAK-STAT6和Akt-mTOR信號(hào)通路。以上結(jié)果表明弓形蟲感染后能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化。另一方面為了評(píng)價(jià)M1、M2對(duì)弓形蟲感染和增殖的影響，通過免疫熒光試驗(yàn)和western blot測(cè)定弓形蟲的感染和增殖情況，結(jié)果表明，不同亞型巨噬細(xì)胞對(duì)弓形蟲感染沒有顯著影響，但M1型巨噬細(xì)