水稻紋枯病菌三磷酸甘油醛脫氫酶基因的克隆及其遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建.pdf

1、由立枯絲核菌(Rhizoctonia Solani)引起的水稻紋枯病是世界性的水稻三大病害之一,幾乎所有的稻田都會(huì)發(fā)生紋枯病,全世界平均每年因該病造成的損失稻谷達(dá)數(shù)十億公斤。因此,對(duì)水稻紋枯病菌的研究具有非常重要的科學(xué)和實(shí)際意義。由于缺乏有效的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng),對(duì)該病的研究主要集中在病菌的分類(lèi)、抗性機(jī)制、病害流行與防治等研究。
　　 關(guān)于水稻紋枯病菌的遺傳轉(zhuǎn)化,國(guó)外已有了一些報(bào)道,國(guó)內(nèi)則報(bào)道甚少。對(duì)于立枯絲核菌的轉(zhuǎn)化效率,相關(guān)報(bào)道顯

2、示也是比較低,采用合適的啟動(dòng)子,是能否進(jìn)行高效轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素之一,因此尋找水稻紋枯病菌高效啟動(dòng)子是提高其轉(zhuǎn)化效率的一種途徑。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GPD)在真核細(xì)胞中高效表達(dá),如在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)其含量可達(dá)細(xì)胞內(nèi)可溶蛋白的5％；在面包酵母中其mRNA的量占總mRNA量的2～5％。因此,GPD基因的啟動(dòng)子可能為一

3、強(qiáng)啟動(dòng)子。而且在許多不同的真菌中,GPD基因啟動(dòng)子已經(jīng)被成功地用來(lái)構(gòu)建轉(zhuǎn)化體系。
　　 本研究利用同源克隆及染色體步移策略,從水稻紋枯病菌基因組獲得4613bp片段,NCBI序列同源分析該片段包含了GPD基因,暫命名為RsGPD,預(yù)測(cè)其全長(zhǎng)為1531bp。通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增其CDS序列,分析顯示其擁有10個(gè)內(nèi)含子。Southern雜交結(jié)果顯示,RsGPD在水稻紋枯病菌基因組中以單拷貝形式存在。RsGPD編碼343個(gè)氨基酸的蛋白

4、。蛋白序列同源性分析,RsGPD基因氨基酸同源性與立枯絲核菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)融合群AG-3最高,達(dá)85.52％。此外,在不同融合群的立枯絲核菌中內(nèi)含子的分布及大小具有高度相似性。
　　 根據(jù)RsGPD基因設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增水稻紋枯病菌的GPD啟動(dòng)子。通過(guò)TFSEARCH軟件對(duì)GPD啟動(dòng)子片段進(jìn)行分析,結(jié)果表明此序列含有TATA-box、CAAT-box、G-box、SP1-box及CT rich-motif等順式作用元件。采用PlantCA

5、RE數(shù)據(jù)庫(kù)及TFSitescan service軟件分析GPD啟動(dòng)子片段,結(jié)果表明,該片段含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子如 ADR1、GATA-box、CCAAT-box、StuA-type、GCR1及GCN4等結(jié)合位點(diǎn)。
　　 以pCAMBIA1300X質(zhì)粒為骨架,構(gòu)建3個(gè)以水稻紋枯病菌GPD啟動(dòng)子啟動(dòng)潮霉素抗性基因的表達(dá)載體,其中2個(gè)載體的潮霉素基因做了如下改進(jìn),通過(guò)Over-lap PCR將潮霉素基因的5’端的160bp-195bp區(qū)間

6、的AT轉(zhuǎn)變?yōu)镚C或在潮霉素基因兩端添加水稻紋枯病菌的漆酶(Z54277)內(nèi)含子。利用上述質(zhì)粒,進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻紋枯病菌菌絲體及菌絲球。最終在農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻紋枯病菌菌絲球中,獲得了轉(zhuǎn)化子。然而這些轉(zhuǎn)化子在繼代培養(yǎng)中,潮霉素抗性性狀,出現(xiàn)了丟失的現(xiàn)象。表型分析表明,這些轉(zhuǎn)化子為非整合轉(zhuǎn)化(Transienttransformation)即DNA未整合至染色體上,而是游離在基因組之外,因而在生長(zhǎng)或繼代的過(guò)程中丟失。此外,轉(zhuǎn)化子獲得數(shù)