黃顙魚源嗜水氣單胞菌的分離鑒定及對三種氟喹諾酮類藥物和氟苯尼考的耐藥性研究.pdf

1、嗜水氣單胞菌是一種能引起魚類等水產(chǎn)動物敗血癥、危害性極大、可造成水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失的病原菌。喹諾酮類藥物、氟苯尼考因具價(jià)格低、廣譜高效、副作用小等特點(diǎn)而成為近年來水產(chǎn)常用的治療藥物。但近幾年來也看到不少如大腸桿菌、鏈球菌、殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌等菌株對氟喹諾類酮藥物的耐藥性在日益增強(qiáng)的報(bào)道。嗜水氣單胞菌作為淡水漁業(yè)危害極大的病原菌，了解其對三種喹諾酮類藥物和氟苯尼考的耐藥分子機(jī)制，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和科學(xué)用藥，建立實(shí)驗(yàn)室耐

2、藥模式菌等均有重大的意義。
　　 本試驗(yàn)從廣西永福、梧州、桂平3個(gè)養(yǎng)殖區(qū)域12批次的黃顙魚病樣中共分離鑒定到細(xì)菌30株，其中16株為嗜水氣單胞菌，占已鑒定菌株總數(shù)的53.33％，說明嗜水氣單胞菌是黃顙魚病害中檢出率較高的細(xì)菌，在這16株嗜水氣單胞菌中，有12株為β型溶血，4株不溶血。對這16株嗜水氣單胞菌進(jìn)行了致病性感染試驗(yàn)，結(jié)果顯示，除了YF13這株非溶血株無致病性外，其余15菌株均為致病性菌株，但致病菌株間的致病力存在一定差

3、異。
　　 K-B紙片法藥敏結(jié)果顯示，15株黃顙魚源嗜水氣單胞菌對19種藥物敏感率分別為OXA(6.7％)、AMP(0.0％)、FOR(86.7％)、CEF(46.6％)、ROC(100％)、STR(87.6％)、GEN(100％)、SXT(40.0％)、NEO(93.3％)、SUL(73.3％)、NOV(6.7％)、NOR(100％)、ENR(100％)、LEV(100％)、ENO(60.0％)、OFL(100％)、CEF(8

4、0.0％)、FLR(93.3％)、SAR(93.3％);微量稀釋法試驗(yàn)結(jié)果:15株菌株除一株對SAR中介外，其余為敏感，15株菌株對ENR、OFL敏感，所測8株菌對FLR敏感。
　　 對3種喹諾酮類藥物和氟苯尼考進(jìn)行耐藥性的獲得速率試驗(yàn)結(jié)果顯示，嗜水氣單胞菌經(jīng)3種喹諾酮類藥物和氟苯尼考耐藥誘導(dǎo)后，均獲得很高的耐藥性，其中采于梧州、桂平的菌株對SAR耐藥率較永福的總體要低，梧州株為256倍，桂平株均低于256倍，永福株獲得速率最小

5、為512倍，最大的為2048倍，且大部分永福菌株獲得速率均大于512倍;采集于梧州、桂平的菌株對ENR耐藥率較永福的總體要低，梧州株低于128倍，桂平株低于512倍，永福株獲得耐藥率最小為32倍，最大為2048倍，且大部分永福菌株增大512倍;采集于梧州、桂平的菌株對OFL耐藥率較永福的總體要低，梧州株低于512倍，桂平株低于512倍，永福株獲得耐藥率最小為128倍，最大為2048倍，且大部分永福菌株增大1024倍;所測菌株對FLR均獲

6、得了穩(wěn)定的耐藥性，但相對喹諾酮類藥物增幅普遍不大，獲得的速率最大的是GP35，為512倍，最小的是WZ02和GP32，為16倍，此外，耐藥突變株還存在對同類藥物較高的耐藥性，對不同類藥物也存在一定的交叉耐藥性。
　　 耐藥突變株耐藥性的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，15株菌株除了YF04菌株對ENR、OFL藥物的耐藥性呈現(xiàn)逐漸減弱的趨勢，分別從20μg/ml、160μg/ml降低為10μg/ml、80μg/ml，其余菌株對SAR、EN

7、R、OFL、FLR均保持穩(wěn)定的耐藥遺傳性;耐藥突變株的保存條件探討試驗(yàn)結(jié)果顯示，耐藥突變株基本表現(xiàn)出對SAR、ENR、OFL、FLR藥物的耐藥性呈現(xiàn)減弱的趨勢，但變化幅度較小，其中對SAR、ENR、OFL降低的倍數(shù)最大為4倍，對FLR藥物降低的倍數(shù)最小為8倍。說明大部分耐藥突變株均保持比較穩(wěn)定的耐藥遺傳性，為建立未來耐藥模式菌株提供了基礎(chǔ)。
　　 對4株臨床分離株和6株喹諾酮耐藥突變株的gyrA和parC基因的QRDR區(qū)進(jìn)行PC

8、R擴(kuò)增、克隆和測序，并采用NCBI、DNAstar、DNAman分析軟件分析。結(jié)果顯示，gyrA基因:桂平臨床分離株GP31和GP35之間同源性為100％，GP31和GP35菌株與永福的臨床分離株YF04、YF11同源性為98.8％;永福臨床分離株YF04、YF11之間的同源性為99％，耐藥突變株之間的同源性為100％。parC基因:桂平的臨床分離的敏感株GP31和GP35之間的同源性達(dá)為100％，GP31和GP35菌株與永福臨床分離株

9、YF04和YF11之間的同源性分別為97.1％和96.9％;永福臨床分離株YF04與YF11之間的同源性為96.9％，耐藥突變株之間的同源性為100％。序列分析表明，相對臨床分離敏感株，耐藥突變株的gyrA、parC基因的QRDR區(qū)各有1個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，其中g(shù)yrA基因上第83位點(diǎn)發(fā)生了突變，為Ser→Ile，parC基因上第87位點(diǎn)發(fā)生了突變，為Ser→Ile，gyrA基因Ser83突變且parC基因Ser87突變與菌株的耐藥存在一