銅綠假單胞菌對氟喹諾酮類藥物耐藥動(dòng)態(tài)演變分子機(jī)制的體外研究.pdf

1、目的:銅綠假單胞菌的染色體介導(dǎo)氟喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制主要有耐藥決定選擇區(qū)(QRDR)基因突變及外排系統(tǒng)表達(dá)上調(diào)，本研究旨在考察銅綠假單胞菌對氟喹諾酮類藥物耐藥的動(dòng)態(tài)演變分子機(jī)制，及耐藥機(jī)制間的相互作用。
　　研究方法:對銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853進(jìn)行耐不同濃度左氧氟沙星及環(huán)丙沙星藥物耐藥菌株的體外篩選，采用Sanger測序法和高通量測序法對耐藥菌株進(jìn)行QRDR區(qū)域耐藥基因突變檢測，采用Real-time PCR法進(jìn)行外

2、排系統(tǒng)蛋白mRNA水平檢測，以銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC27853作為對照。
　　結(jié)果:環(huán)丙沙星較左氧氟沙星相比有更強(qiáng)的殺菌能力。本研究共找到五種不同的QRDR區(qū)域耐藥基因突變，gyrA基因突變?yōu)殂~綠假單胞菌對氟喹諾酮類藥物耐藥主要突變位點(diǎn)，gyrB基因突變和parE基因突變可與之結(jié)合起到增強(qiáng)耐藥能力的作用;左氧氟沙星組出現(xiàn)大量耐藥基因突變在4 mg/L篩選濃度下，而環(huán)丙沙星組對應(yīng)在2 mg/L篩選濃度下。在外排系統(tǒng)表達(dá)上調(diào)耐藥機(jī)

3、制中，以MexC的mRNA水平上調(diào)為最主要，MexE與MexX的mRNA水平上調(diào)可增強(qiáng)銅綠假單胞菌耐藥能力;環(huán)丙沙星組出現(xiàn)首先mRNA水平上調(diào)在0.25 mg/L，對應(yīng)左氧氟沙星組在0.5mg/L;MexC第二次明顯mRNA水平上調(diào)在左氧氟沙星組和環(huán)丙沙星組分別為2mg/L和1 mg/L。通過高通量測序法發(fā)現(xiàn)parE基因突變頻率在8MIC、32MIC及64MIC左氧氟沙星篩選濃度下分別為31.2％、45.8％及98.6％，還發(fā)現(xiàn)未在Sa

4、nger測序中發(fā)現(xiàn)的編碼parC的36位氨基酸基因突變。當(dāng)有g(shù)yrA83基因突變時(shí)，MexC的mRNA水平明顯下調(diào)，當(dāng)無gyrA83突變時(shí)或在gyrA83基因突變之前，可見MexC表達(dá)與MexE表達(dá)間存在相互協(xié)同現(xiàn)象。
　　結(jié)論:銅綠假單胞菌對氟喹諾酮類耐藥機(jī)制中以gyrA基因突變和MexC的mRNA水平上調(diào)為主，且存在相互協(xié)同作用。高通量測序發(fā)現(xiàn)，gyrA基因突變頻率最高，隨篩選濃度的不斷遞增，parE基因突變頻率呈遞增趨勢。環(huán)