6種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類常見弧菌抗原芯片檢測技術(shù)的建立.pdf

1、近年來我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)飛速發(fā)展,養(yǎng)殖的水產(chǎn)動物種類日益增多,隨著集約化養(yǎng)殖形式和養(yǎng)殖密度不斷擴大,病原、宿主與環(huán)境之間的相互作用導(dǎo)致水產(chǎn)動物的抵抗力降低,發(fā)病日趨頻繁。細菌性疾病是水產(chǎn)動物最常見的一類疾病,是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類的主要病害,其中以弧菌病流行最為廣泛?；【鷱V泛分布于海洋環(huán)境中,可以感染多種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類并造成嚴重死亡,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。
　　抗原芯片的基本原理是將抗原固定在芯片載體上制備成檢測芯片,檢測血清中相

2、對應(yīng)的抗體,近些年己被廣泛應(yīng)用于臨床學(xué)和流行病學(xué)?？乖酒蚱渚哂懈哽`敏性、高特異性、高通量及多樣品或多指標平行分析的優(yōu)點,在病原檢測方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景。但目前將抗原芯片應(yīng)用于水產(chǎn)動物細菌性疾病檢測的相關(guān)報道較少,因此本文將抗原芯片技術(shù)與水產(chǎn)動物免疫學(xué)原理相結(jié)合,選取魚腸道弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌、哈維氏弧菌6種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類常見弧菌為研究對象,構(gòu)建水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類常見弧菌的抗原芯片,并進行實際應(yīng)用,證明構(gòu)建的抗原芯

3、片可以應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類6種常見弧菌性疾病的準確診斷。具體結(jié)果如下:
　　(1)在確認各弧菌菌株致病性的基礎(chǔ)上,提取各弧菌的外膜蛋白、胞外產(chǎn)物、鞭毛蛋白等抗原組分以及全菌超聲波破碎液,考馬斯亮藍法測定各抗原組分濃度,以HIRP標記牙鲆免疫球蛋白單克隆抗體,進行了病原性確認。結(jié)果顯示,提取的各弧菌抗原組分均可與對應(yīng)的牙鲆抗血清發(fā)生反應(yīng),說明其病原性良好,可以用來構(gòu)建抗原芯片。
　　(2)采用滅活全菌注射健康牙鲆,獲取各弧菌的牙

4、鲆抗血清;ELISA檢測牙鲆抗血清的效價變化并分析各抗原組分與牙鲆抗血清的交叉反應(yīng)情況。結(jié)果顯示,牙鲆的抗體水平不斷上升,在第4、5、6周達到最高,由此選取4-6周的抗血清用于后續(xù)抗原芯片的檢測。各弧菌的牙鲆抗血清均與對應(yīng)弧菌的反應(yīng)程度最強烈,與其他種類的弧菌存在程度不等的交叉反應(yīng),而胞外產(chǎn)物和鞭毛蛋白的交叉反應(yīng)很小,確認了抗原芯片構(gòu)建的可行性。
　　(3)采用前期優(yōu)化的芯片載體、點樣緩沖液、固定時間、封閉時間、抗體孵育時間及清洗

5、緩沖液;將同一弧菌的多種抗原組分點樣于芯片載體組成一個矩陣,構(gòu)建6種弧菌抗原芯片,并對牙鲆抗血清進行檢測。結(jié)果顯示,牙鲆抗血清與對應(yīng)弧菌的各矩陣點全部顯色,與其他弧菌的矩陣點無顯色反應(yīng)或部分顯色,說明構(gòu)建的抗原芯片可以用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物常見的6種致病性弧菌的準確檢測。
　　(4)將制備的抗原芯片應(yīng)用子人工感染牙鲆和自然發(fā)病大菱鲆的疾病檢測。結(jié)果顯示,人工感染的牙鲆抗血清與抗原芯片上鰻弧菌的各抗原矩陣點反應(yīng)完全,自然發(fā)病的大菱鲆抗血清