中國部分地區(qū)CSFV與PRRSV流行情況調(diào)查與PRRSV標(biāo)記毒株的研究.pdf

1、2006年，我國豬群中暴發(fā)一種以高熱、腹式呼吸、咳嗽、食欲不振、便秘或腹瀉、眼分泌物增多等為主要癥狀的傳染病。最初對該病的病因沒有明確定論，故將之定名為“豬無名高熱”或“豬高熱病”。為了研究“豬高熱病”中主要病毒性病原在國內(nèi)的流行情況，本研究對豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬瘟病毒進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查;分析了PRRSV國內(nèi)流行株與國內(nèi)外其它毒株間的遺傳演化關(guān)系。在對病原基因組本身認(rèn)識加深的基礎(chǔ)上，利用反向遺傳學(xué)手段獲得了一株P(guān)RRSV標(biāo)記毒

2、株株并對其進(jìn)行了初步免疫實驗研究;進(jìn)一步對PRRSV活病毒載體疫苗的可行性進(jìn)行了探索。
　　 本研究為我國豬群中主要病毒病原的分子流行病學(xué)特征提供科學(xué)依據(jù)，同時也為PRRSV的防控提供了新的思路，奠定了理論基礎(chǔ)。本研究具體內(nèi)容如下:
　　 1、中國部分地區(qū)豬瘟病毒分子流行病學(xué)調(diào)查
　　 為了研究中國豬瘟病毒(CSFV)的分子流行病學(xué)，本試驗用巢式RT-PCR檢測2008年1月到2011年3月送檢的不同豬場病料，并

3、對其中103個CSFV分離株的E2基因序列進(jìn)行分析。進(jìn)化分析結(jié)果表明這些毒株分屬1群的1.1亞群和2群的2.1和2.2亞群，沒有3群毒株存在。2.1亞群毒株為優(yōu)勢流行毒株，流行范圍覆蓋大陸絕大部分地區(qū)。這些結(jié)果豐富了國內(nèi)CSFV基因變異情況的數(shù)據(jù)，將為新的診斷方法的建立、流行病學(xué)監(jiān)測以及有效的防控措施制定提供理論基礎(chǔ)。
　　 2、中國部分地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒分子流行病學(xué)調(diào)查
　　 對來自2006-2010年中國15

4、個不同省、自治區(qū)、直轄市的疑似豬繁殖與呼吸合征（PRRS）發(fā)病豬場的送檢病料進(jìn)行豬繁殖與呼吸合征病毒(PRRSV)的檢測，并對其部分ORF5基因進(jìn)行測序，以確定當(dāng)前PRRSV在中國的分子流行病學(xué)特征，并分析PRRSV在中國的遺傳變異規(guī)律。使用RT-PCR的方法對采集的樣品進(jìn)行PRRSV檢測，并對PRRSV檢測呈陽性的69份病料進(jìn)行ORF5基因的序列測定和分析。1196份病料中共檢測到247份陽性樣品，陽性率為20.7％。對ORF5序列進(jìn)

5、行分析表明，69株P(guān)RRSV毒株序列均屬于2型，與GenBank中高致病性藍(lán)耳病（HP-PRRSV）參考毒株的氨基酸同源性為94.0％-100％。所測序列與PRRSV參考株一并，共可分為5個亞型，亞型Ⅳ與HP-PRRSV遺傳距離最近。同時，進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，69個毒株在空間分布上存在散在性，來源于不同省市的PRRSV毒株的遺傳關(guān)系存在交叉，病毒分型并沒有呈現(xiàn)明顯的地域性;PRRSV在中國的流行株為HP-PRRSV，PRRSV在目前中國

6、的遺傳演進(jìn)相對穩(wěn)定。
　　 3、PRRSV中國流行株全基因組序列的測定與分析
　　 為了進(jìn)一步研究豬繁殖與呼吸綜合征病毒在國內(nèi)的遺傳變異情況及分子生物學(xué)特征，本研究在上一章研究的基礎(chǔ)上，對一株國內(nèi)分離株JS0922株進(jìn)行了全基因組的序列測定。根據(jù)ATCC VR-2332標(biāo)準(zhǔn)株和JX143高致病性藍(lán)耳病代表株的序列設(shè)計引物，對1株2009年的PRRSV江蘇分離毒株JS0922全基因進(jìn)行了分段擴增并測序，將測序結(jié)果拼接后，得

7、到病毒的全基因，然后進(jìn)行序列的比對分析。分析數(shù)據(jù)顯示，PRRSV JS0922株屬于基因2毒株，它與2006年以前的分離株相比存在明顯差異，與國內(nèi)早期BJ-4株的核苷酸同源性僅為89％;而與高致病藍(lán)耳病病毒(HP-PRRSV)的同源性較高，達(dá)98％以上。就基因組各開放閱讀框而言，JS0922的ORF3、ORF4基因變異較大，ORF6則較為保守。分析發(fā)現(xiàn)，JS0922基因組具有HP-PRRSV的分子特征，但部分位點氨基酸的突變明顯區(qū)別于H

8、P-PRRSV。綜上，JS0922毒株發(fā)生了部分變異，具備了一些新的特點，但總體上劃歸于HP-PRRSV演化中的一個分支，屬于目前國內(nèi)PRRSV的優(yōu)勢流行株。
　　 4、豬繁殖與呼吸綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白N蛋白N端非必需區(qū)的研究
　　 為了確定豬繁殖與呼吸綜合征病毒nucleocapsid(N)蛋白N末端非重疊區(qū)域的非必需區(qū)的范圍，我們在單純將PRRSV ORF6與ORF7重疊區(qū)拉開的背景質(zhì)粒上進(jìn)行了系列研究。本實驗參照骨架

9、質(zhì)粒p7PNX的序列設(shè)計引物，選取其N蛋白N端從起始密碼子之后的氨基酸進(jìn)行系列缺失，構(gòu)建一系列缺失突變體。通過轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞進(jìn)行病毒拯救，確定在ORF7無重疊區(qū)的情況下，N末端的2-7位氨基酸對于病毒的感染性是非必需的。對缺失體盲傳后發(fā)現(xiàn)，缺失區(qū)域在體外遺傳性能穩(wěn)定。對缺失體進(jìn)行多步生長曲線和空斑實驗，發(fā)現(xiàn)缺失體生長動力學(xué)和空斑形態(tài)學(xué)特征與野生型相似。本研究首次確定了2型PRRSV的N蛋白non-overlapping背景下N末端

10、的缺失區(qū)域，為進(jìn)一步解析N蛋白結(jié)構(gòu)與功能、創(chuàng)制新型基因工程標(biāo)記疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　 5、豬繁殖與呼吸綜合征結(jié)構(gòu)蛋白N蛋白標(biāo)記毒株的構(gòu)建及初步免疫實驗研究
　　 當(dāng)前的PRRSV疫苗對疫苗免疫豬和自然感染豬上無法提供血清學(xué)鑒別。因此，我們需要利用新的方法制備一種新型的，更為有效的疫苗。利用反向遺傳技術(shù)，我們構(gòu)建了一個基因標(biāo)記毒株—v7APMa，該候選株的核衣殼蛋白與野生毒株（vAPRRS，2型PRRSV）有所差異。v7A

11、PMa在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中顯示了良好的遺傳穩(wěn)定性，并且其基因標(biāo)記的病毒特性在子代病毒中能夠很好的得到復(fù)制。在體內(nèi)感染實驗中，標(biāo)記病毒v7APMa和親本病毒vAPRRS一樣，能夠誘導(dǎo)感染豬產(chǎn)生相當(dāng)水平的抗N蛋白抗體，也能誘導(dǎo)相似滴度的中和抗體。同時，兩組免疫組仔豬血清中的IL-4和IFN-γ的含量也明顯升高。說明標(biāo)記病毒和親本病毒一樣，能夠刺激機體產(chǎn)生正常的免疫應(yīng)答。v7APMa感染豬在在感染后14天能夠產(chǎn)生抗基因標(biāo)記特異性多肽的抗體。但是

12、vAPRRS和對照組在整個過程未能產(chǎn)生針對基因標(biāo)記特異性多肽的抗體。說明診斷ELISA方法能夠區(qū)分vAPRRS病毒和標(biāo)記病毒v7APMa。在實驗28天PRRSV強毒株JX143攻毒后，對照組出現(xiàn)典型的PRRS臨床癥狀，表現(xiàn)為體溫升高、食欲下降，眼瞼水腫，流鼻涕，咳嗽，皮膚發(fā)紅等臨床癥狀，且在攻毒后11天和14天分別有1頭仔豬死亡。而v7APMa和vAPRRS免疫的豬體溫也有體溫升高，但持續(xù)時間短，臨床癥狀較輕，無豬只死亡。說明vAPRR

13、S和v7APMa均可以對異源毒株JX143攻毒提供一定的免疫保護(hù)。結(jié)果表明，通過這種新的方法制備出的基因標(biāo)記毒株為PRRSV標(biāo)記疫苗的創(chuàng)制提供了新的思路。
　　 6、豬繁殖與呼吸綜合征病毒活載體疫苗候選株的構(gòu)建及其病毒學(xué)特性的研究
　　 為了獲得以PRRSV作為活病毒載體的疫苗候選株，并探究在PRRSV的ORF4與ORF5之間運載外源蛋白基因的可行性，本實驗將(equine arteritis virus，EAV)的OR

14、F4嵌合入PRRSV基因組中，經(jīng)PCR、酶切和基因測序鑒定，篩選獲得陽性重組質(zhì)粒pAPRRS(EAV4)。轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的BHK-21細(xì)胞，拯救獲得了重組嵌合病毒vAPRRS(EAV4)。經(jīng)MARC-145連續(xù)傳代，證明其基因組在體外可以穩(wěn)定遺傳。Northern-blot、亞基因組測序和間接免疫熒光表明，PRRSV自身基因組可完成復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯各過程，但嵌合入的EAV的ORF4沒有轉(zhuǎn)錄的發(fā)生。對嵌合體進(jìn)行多步生長曲線和空斑實驗，發(fā)現(xiàn)