中國部分地區(qū)產(chǎn)NDM耐藥菌的流行及耐藥特性研究.pdf

1、產(chǎn)新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（NDM）耐藥菌自2010年被傳染病領域國際頂級雜志《柳葉刀》報道以來，以驚人的傳播速度和超強的耐藥性引起人們的廣泛關注。目前，在全球范圍內(nèi)已有超過20個國家出現(xiàn)產(chǎn)NDM耐藥菌病例，除南美洲西部、非洲中部個別國家未報道外，其他國家和地區(qū)均有報道。攜帶blaNDM基因耐藥菌對包括碳青霉烯類的常用抗菌藥物均耐藥，尚缺乏明確的治療方案。研究發(fā)現(xiàn)，NDM-1有NDM-2到NDM-16共15個突變體，多由不動桿菌屬細菌、大

2、腸埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌攜帶。越來越多的數(shù)據(jù)表明產(chǎn)NDM耐藥菌已在全球范圍流行并引發(fā)多種類型感染，是威脅人類健康的主要公共衛(wèi)生問題之一。因此，有效控制和治療產(chǎn)NDM耐藥菌感染具有重要現(xiàn)實意義。
　　細菌耐藥監(jiān)測是防控產(chǎn)NDM耐藥菌的重要組成部分，及時準確了解產(chǎn)NDM耐藥菌的流行現(xiàn)狀和特點，是預防和控制產(chǎn)NDM耐藥菌感染的關鍵所在。既往研究發(fā)現(xiàn)，我國主要以攜帶blaNDM-1基因的不動桿菌為主，而關于其他NDM型別和其他菌屬在我國

3、的流行特點，研究報道甚少。為更全面了解產(chǎn)NDM耐藥菌在我國的流行現(xiàn)狀、流行規(guī)律及傳播機制，本課題對2010年至2015年期間來自全國11個省市、25家醫(yī)院的1559株非重復碳青霉烯類耐藥菌（含醫(yī)院污水來源156株）進行分析檢測，采用聚合酶鏈式反應（PCR）法篩查blaNDM基因，運用流行病學及統(tǒng)計分析方法對不同來源、不同菌屬、不同型別產(chǎn)NDM耐藥菌引起感染性疾病的三間分布進行分析；利用基于全基因組平均核苷酸一致性（ANI）分析法及16s

4、RNA序列分析對產(chǎn)NDM耐藥菌進行菌種鑒定，利用核心基因組多位點序列分型（cgMLST）方法，對不同菌屬產(chǎn)NDM耐藥菌進行聚類分型；VITEK2全自動微生物藥敏分析儀對攜帶blaNDM基因菌株進行耐藥性分析；同時，利用Southern blot雜交法、濾膜接合法和細菌全基因組測序分別對其進行blaNDM基因定位及轉(zhuǎn)移特性、blaNDM基因周邊結(jié)構(gòu)分析，以期明確中國部分地區(qū)產(chǎn)NDM耐藥菌的分子特征，從分子水平解釋產(chǎn)NDM耐藥菌blaNDM

5、基因可能的傳播和流行規(guī)律。
　　本研究的主要結(jié)果和結(jié)論如下：
　　1.不同型別、不同菌屬產(chǎn)NDM耐藥菌已在中國部分地區(qū)流行播散。
　　1559株實驗菌中篩查出77株攜帶blaNDM基因菌株，陽性率為4.9％。
　　1）時間分布特點：患者來源耐藥菌的blaNDM基因陽性率逐年升高。
　　2）空間分布特點：我國東北、華北、華東、中南四大地區(qū)，11個城市均有
　　產(chǎn)NDM耐藥菌，其中北京、上海、?？凇B門等

6、一線和沿海城市陽性菌株數(shù)量較多、陽性率較高，且產(chǎn)NDM耐藥菌在醫(yī)院污水中廣泛存在。
　　3）人群分布及標本來源分布特點：產(chǎn) NDM耐藥菌患者來源中，男性顯著多于女性，年齡低于10歲的兒童及大于60歲的老人顯著多于其他年齡段患者，推測男性兒童和老年人是感染產(chǎn)NDM耐藥菌的易感人群；呼吸內(nèi)科是 blaNDM基因陽性菌檢出最多的科室，痰液標本顯著多于糞便、血液和尿液等其他標本，推測相比其他傳播方式，產(chǎn)NDM耐藥菌更易通過呼吸道感染和擴散

7、。
　　4）基因型別特點：本研究發(fā)現(xiàn)blaNDM的四種基因型，包括blaNDM-1、blaNDM-3、blaNDM-5和 blaNDM-13。產(chǎn)NDM-1耐藥菌最多，產(chǎn) NDM-5耐藥菌次之，NDM-5為第二優(yōu)勢型別，且在北京、沈陽、?？?、濟南、上海等多個城市均有發(fā)現(xiàn)，提示攜帶blaNDM-5基因菌株也已在中國廣泛傳播流行。
　　5）菌屬類別特點：產(chǎn) NDM耐藥菌中，不動桿菌屬細菌數(shù)量最多，其次是肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌

8、，近年來產(chǎn)NDM肺炎克雷伯氏菌和產(chǎn)NDM大腸埃希氏菌已在中國部分地區(qū)流行。首次發(fā)現(xiàn)1株產(chǎn)NDM-3耐藥大腸埃希氏菌和1株攜帶blaNDM-13基因腸炎沙門氏菌，且產(chǎn)NDM-1、NDM-3、NDM-5、NDM-13耐藥菌已蔓延至腸道病原菌。
　　2.利用ANI分析可成功鑒定不動桿菌屬菌種。
　　首次利用ANI分析方法對產(chǎn)NDM耐藥不動桿菌屬細菌進行菌種鑒定，38株產(chǎn)NDM耐藥不動桿菌屬細菌中，有5株托尼爾氏不動桿菌被16S r

9、RNA誤鑒定為其他菌種，其中3株被鑒定為鮑氏不動桿菌，1株瓊氏不動桿菌和1株約氏不動桿菌。
　　3. cgMLST對產(chǎn)NDM耐藥菌屬內(nèi)菌株親緣關系研究具有重要意義。
　　cgMLST聚類分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)NDM肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌可能已在不同地區(qū)的人群中傳播，且產(chǎn)NDM托尼爾氏不動桿菌和產(chǎn)NDM乙酸鈣不動桿菌可能已在不同地區(qū)、不同來源中播散。本研究建立產(chǎn)NDM耐藥菌親緣關系研究的cgMLST實驗方法，為產(chǎn)NDM耐藥菌監(jiān)測技

10、術(shù)平臺和分子分型數(shù)據(jù)庫建立打下了堅實基礎。
　　4.中國部分地區(qū)產(chǎn)NDM耐藥菌耐藥譜廣，且不同型別、不同菌屬耐藥譜存在差異。
　　1）產(chǎn)NDM耐藥菌都是多重耐藥菌，多為泛耐藥菌，耐藥譜廣：77株產(chǎn)NDM耐藥菌均對3類以上抗生素耐藥，為多重耐藥菌。所有菌株對氨芐西林、頭孢唑林和頭孢曲松的耐藥率都高達100%，對頭孢他啶和頭孢吡肟兩種抗菌藥物的耐藥率都達到了98.7%，對哌拉西林亦是高水平耐藥，耐藥率為93.5%，對氨曲南的耐藥

11、率高達97.4%；所有菌株對碳青霉烯類的亞胺培南和美羅培南、硝基呋喃類的呋喃妥英、磺胺類的復方新諾明均表現(xiàn)高水平耐藥，只對氨基糖苷類的阿米卡星較為敏感，但耐藥率仍為24.7%。
　　2）產(chǎn)NDM-5菌株耐藥性高于產(chǎn)NDM-1耐藥菌：對不同型別產(chǎn)NDM耐藥菌的耐藥性進行比較，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)NDM-5菌株的耐藥率顯著高于產(chǎn)NDM-1菌株的耐藥率。
　　3）不同菌屬產(chǎn)NDM耐藥菌耐藥譜不同：對不同菌屬產(chǎn)NDM耐藥菌的耐藥性進行比較，發(fā)現(xiàn)不

12、同菌屬產(chǎn)NDM耐藥菌耐藥譜不同，不動桿菌屬細菌對哌拉西林的耐藥率顯著低于其他菌屬，沙門氏菌屬細菌對阿米卡星、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星均敏感，檸檬酸桿菌屬細菌僅對四環(huán)素敏感；埃希氏菌屬細菌僅對阿米卡星表現(xiàn)低水平耐藥。提示，產(chǎn)NDM耐藥菌感染治療與防控過程中，抗菌藥物的適當調(diào)整與合理應用尤為重要。
　　5.相比不動桿菌，攜帶blaNDM基因的質(zhì)粒易在腸桿菌科細菌中傳播，且耐藥性更強。
　　1）blaNDM基因多通過質(zhì)粒在細菌屬內(nèi)及屬

13、間傳播：77株產(chǎn)NDM耐藥菌株的blaNDM-1基因進行定位分析發(fā)現(xiàn)，所有菌株都含有2-5個質(zhì)粒，67株 blaNDM基因定位于質(zhì)粒上，10株blaNDM基因在染色體上。定位于30~50kb大小質(zhì)粒菌株最多，涵蓋多個菌種，可能有優(yōu)勢質(zhì)粒在腸桿菌科細菌及不動桿菌屬細菌間傳播。11株菌2個質(zhì)粒同時含有blaNDM基因，耐藥譜相比其他產(chǎn)NDM耐藥菌較廣，推測多個含耐藥基因質(zhì)?？赡茉鰪娏司甑哪退幮?。耐藥基因在染色體上的產(chǎn)NDM耐藥菌多為不動桿

14、菌屬細菌。
　　2）腸桿菌科細菌比不動桿菌的blaNDM基因更易發(fā)生水平轉(zhuǎn)移：67株blaNDM基因定位于質(zhì)粒的產(chǎn)NDM耐藥菌進行接合轉(zhuǎn)移實驗，49株成功將含blaNDM基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至受體菌J53中，未發(fā)生接合轉(zhuǎn)移菌株中，18株均為不動桿菌屬細菌。
　　3）腸桿菌科細菌blaNDM陽性接合子耐藥性強于不動桿菌：對含blaNDM-1基因陽性接合菌耐藥情況進行評估發(fā)現(xiàn)，所有腸桿菌科菌株具備原始供體菌典型的耐藥性，均對青霉素類、頭

15、孢菌素類和碳青霉烯類抗生素表現(xiàn)出耐藥，而多數(shù)不動菌屬細菌含blaNDM-1基因接合子雖獲得了質(zhì)粒，但卻沒有獲得相應對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥表型，僅對頭孢菌素類表現(xiàn)為耐藥，不具備原始供體菌典型的耐藥性。
　　6.似Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)在blaNDM基因傳播過程中起著重要作用，中國存在產(chǎn)NDM耐藥菌引發(fā)嚴重公共衛(wèi)生問題風險。
　　1）blaNDM基因通過似Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)，在細菌屬內(nèi)及屬間傳播：選取17株不同菌屬、blaNDM

16、-1基因不同位置（質(zhì)粒及染色體）代表菌株，利用菌株二代全基因組測序方法，對其blaNDM-1基因周邊結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，17株產(chǎn)NDM耐藥菌分7種不同型別似Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)，均與pNDM-BJ01的完整Tn125結(jié)構(gòu)不同。
　　2）ISAba125轉(zhuǎn)座酶不是blaNDM基因傳播的必需酶：首次發(fā)現(xiàn)2株Tn125上下游ISAba125轉(zhuǎn)座酶同時發(fā)生丟失的菌株，分別為魯氏不動桿菌和托尼爾氏不動桿菌；之前報道在blaNDM-1基因傳播過程

17、中發(fā)揮重要作用的ISAba125轉(zhuǎn)座酶發(fā)生丟失，由此推斷，ISAba125轉(zhuǎn)座酶不是blaNDM基因傳播的必需酶。
　　3）中國攜帶blaNDM基因菌株源于不動桿菌：結(jié)合上述研究和國內(nèi)外相關報道，及blaNDM-1基因定位于染色體多為不動桿菌屬細菌這一現(xiàn)象，推測blaNDM-1基因在中國最早來源于不動桿菌，blaNDM-1基因多嵌合于不動桿菌屬細菌染色體上，Tn125或似Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)在介導blaNDM-1在不動桿菌屬細菌屬內(nèi)

18、傳播的同時，轉(zhuǎn)移至克雷伯氏菌、埃希氏菌、沙門氏菌等腸桿菌科細菌中。
　　4）中國存在產(chǎn)NDM耐藥菌引發(fā)嚴重公共衛(wèi)生問題風險：結(jié)合接合轉(zhuǎn)移及陽性接合子耐藥實驗發(fā)現(xiàn)，不動桿菌的blaNDM-1基因相比腸桿菌科細菌，不易通過基因水平轉(zhuǎn)移至其他菌株，這可能也是中國到目前為止，未發(fā)生產(chǎn)NDM耐藥菌引發(fā)嚴重公共衛(wèi)生問題的原因。但腸桿菌科細菌的blaNDM-1基因基本都位于質(zhì)粒上，且接合轉(zhuǎn)移后對碳青霉烯類高水平耐藥。隨著產(chǎn)NDM腸桿菌科細菌逐年

19、增多，中國有產(chǎn)NDM耐藥菌引發(fā)嚴重公共衛(wèi)生問題的風險，而blaNDM基因傳播過程所需關鍵調(diào)控因子有待深入研究。
　　綜上所述，本研究通過細菌耐藥監(jiān)測研究，獲得產(chǎn)NDM耐藥菌感染發(fā)生率和耐藥現(xiàn)狀，發(fā)現(xiàn)不同型別、不同菌屬產(chǎn)NDM耐藥菌在中國部分地區(qū)流行播散；我國產(chǎn)NDM耐藥菌耐藥譜廣，且不同型別、不同菌屬耐藥譜存在差異，這些結(jié)果為臨床治療產(chǎn)NDM耐藥菌引起的重癥感染，制訂科學、有效的預防和控制措施提供了重要的實驗依據(jù)。進一步對中國部分

20、地區(qū)產(chǎn)NDM耐藥細菌進行遺傳多態(tài)性、基因定位及轉(zhuǎn)移特性、blaNDM基因周邊結(jié)構(gòu)等研究，初步闡明了blaNDM-1基因在中國最早來源于不動桿菌，在屬內(nèi)傳播的同時，轉(zhuǎn)移至克雷伯氏菌、埃希氏菌、沙門氏菌等腸桿菌科細菌中。而產(chǎn)NDM耐藥腸桿菌科細菌比產(chǎn)NDM耐藥不動桿菌的blaNDM基因更易發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移后具備供體菌典型的碳青霉烯類抗菌藥物耐藥性。隨著被報道產(chǎn)NDM腸桿菌科細菌數(shù)目逐年增加，推測中國存在產(chǎn)NDM耐藥菌引發(fā)嚴重公共衛(wèi)生