喹賽多對恒化器模型中人腸道菌群的影響.pdf

1、喹賽多是喹噁啉類一種新型的抗菌促生長劑，能促進畜禽及水產(chǎn)動物生長、提高動物生產(chǎn)性能，并能有效降低疾病的感染率，安全低毒高效的特性使其在畜牧業(yè)中有較好的研究及應(yīng)用前景。雖然實驗室前期對喹賽多的代謝及殘留消除規(guī)律進行了系統(tǒng)研究，毒理學(xué)方面的研究顯示為一類安全性較高的藥物，而目前還未從微生物學(xué)安全性的角度進行分析，因此為了保證食品安全，有必要考察喹賽多殘留是否對人的腸道菌群有負(fù)面效應(yīng)，對腸道菌群結(jié)構(gòu)、代謝活性、耐藥率及定植屏障功能的發(fā)揮是否有

2、干擾，同時抗菌藥微生物影響作用又是食品安全評估中要求進行的一項重要內(nèi)容，因此本試驗應(yīng)用離體恒化器模型，系統(tǒng)評價不同劑量喹賽多對人腸道微生物菌群的作用，豐富其微生物學(xué)安全性方面的資料，為喹賽多申報和進一步推廣使用提供全面科學(xué)的資料。
　　 1、喹賽多對腸道菌群的影響
　　 本研究采用FDA推薦使用的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)研究喹賽多對人結(jié)腸菌群的影響。首先進行喹賽多及其主要代謝物對腸道菌株(大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、脆弱擬桿菌)的藥

3、敏試驗，發(fā)現(xiàn)喹賽多主要代謝物Cy1、Cy2、Cy4、Cy6、Cy10、Cy12與原形喹賽多相比均沒有抗菌活性，因此模型系統(tǒng)中僅考慮喹賽多對結(jié)腸菌群的微生物學(xué)效應(yīng)。根據(jù)喹賽多對臨床分離的四種優(yōu)勢菌的藥敏的范圍是1-16μg/mL，設(shè)計了包含此范圍的一系列不同濃度0.5-128μg/mL在厭氧箱中與糞樣孵育，通過對四種優(yōu)勢菌數(shù)量及兼性需氧厭氧菌(大腸桿菌、腸球菌)耐藥率考察，最終確定終濃度為4μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、12

4、8μg/mL在模型中進行預(yù)試。
　　 模型接種糞樣后第7d達到平衡，于第13d添加終濃度為4μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、128μg/mL的喹賽多，考察不同濃度作用下對四種優(yōu)勢菌(大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、脆弱擬桿菌)數(shù)量影響、短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)影響及兼性需氧厭氧菌耐藥率變化(大腸桿菌、腸球菌)，連續(xù)給藥7天，第21d接種108CFU/mL的鼠傷寒沙門氏菌1mL，接種三天，通過采樣計數(shù)沙門氏菌的數(shù)量來

5、判斷腸道菌群的定植屏障功能是否破壞。
　　 在4μg/mL、16μg/mL劑量下發(fā)現(xiàn)對腸道代表菌株的數(shù)量、短鏈脂肪酸、兼性需氧厭氧菌耐藥率及沙門氏菌數(shù)量均在95%置信范圍內(nèi)，也就是說，這兩個劑量組對腸道菌群沒有影響。加藥期間這兩個劑量組下大腸桿菌數(shù)量保持在106CFU/mL濃度，腸球菌濃度104CFU/mL，雙歧桿菌、脆弱擬桿菌濃度107CFU/mL，均在95%置信范圍內(nèi)，也均在正常生理值范圍內(nèi)；對鼠傷寒沙門氏菌的數(shù)量計數(shù)分析，

6、也發(fā)現(xiàn)4μg/mL、16μg/mL劑量下沙門氏菌數(shù)量與對照組相比沒有差異，在模型內(nèi)沒有增值的趨勢。
　　 相反地，32μg/mL、128μg/mL這兩個劑量組對四種觀測指標(biāo)則有不同程度的影響。加藥期間對四種代表菌株數(shù)量均有影響，厭氧菌(雙歧桿菌、脆弱擬桿菌)數(shù)量降低程度更明顯；大腸桿菌、腸球菌耐藥率增加；沙門氏菌數(shù)量與對照組相比有差異，在模型中有增值的趨勢，腸道菌群的定植抗力作用受到破壞；但是32μg/mL、128μg/mL劑量

7、組并沒有影響短鏈脂肪酸的濃度，加藥期間乙酸、丙酸、丁酸的濃度均在95%置信范圍內(nèi)，可能與模型系統(tǒng)不能模擬腸道吸收功能有關(guān)，使短鏈脂肪酸濃度變化不是很明顯。在恒化器模型中通過對4μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、128μg/mL劑量的考察結(jié)果顯示，16μg/mL劑量組對考察的指標(biāo)沒有影響，不會擾亂人腸道菌群的平衡。
　　 2、大腸桿菌及腸球菌耐藥方式分析
　　 模型加藥前期(第8-13d)及加藥期(第14-20d

8、)從模型中采取樣品分離耐藥大腸桿菌和腸球菌，加藥前期32μg/mL模型中分離大腸桿菌和腸球菌各10株；128μg/mL劑量組大腸桿菌和腸球菌各分離9株。加藥期間，32μg/mL濃度下耐藥大腸桿菌和腸球菌各14株，128μg/mL劑量組耐藥大腸桿菌和腸球菌各分離13株。首先對分離的耐藥大腸桿菌、腸球菌進行耐藥表型分析，發(fā)現(xiàn)模型加藥前后分離大腸桿菌對喹噁啉類藥物耐藥嚴(yán)重(MIC≥64μg/mL)，此外還對β-內(nèi)酰胺類藥物耐(MIC≥128μ

9、g/mL)。設(shè)計引物對分離耐藥大腸桿菌和腸球菌進行喹噁啉類耐藥基因oqxAB擴增，檢測我們臨床的分離的耐藥菌中是否有這種耐藥基因，目的片段oqxA和oqxB的大小分別是670bp和520bp。加藥前期32μg/mL濃度分離的10株大腸桿菌中3株有oqxAB基因，128μg/mL濃度下9株耐藥大腸桿菌中有1株有oqxAB基因；加藥期間32μg/mL濃度模型14株耐藥大腸桿菌有5株有oqxAB基因，128μg/mL劑量組13株耐藥大腸桿菌中

10、有3株檢測有oqxAB目的條帶，模型加藥前后分離大腸桿菌都是耐藥的，即加藥前模型耐藥大腸桿菌是固有耐藥的，32、128μg/mL劑量組大腸桿菌耐藥率增加是藥物對固有耐藥大腸桿菌的選擇作用，固有耐藥大腸桿菌過度生長繁殖表現(xiàn)耐藥率增加，有研究報道厭氧條件下喹賽多對大腸桿菌的MBC≤32μg/mL，因此模型中這兩個劑量組下不可能誘導(dǎo)耐藥菌的產(chǎn)生。而我們加藥前期及加藥期間分離的耐藥腸球菌卻都沒有oqxAB基因，可能是別的耐藥基因介導(dǎo)，有待進一步

11、研究。而對攜帶有oqxAB基因的大腸桿菌進一步分析耐藥方式，提取質(zhì)粒，并作為擴增模板，仍有oqxAB基因目的片段大小正確的條帶，之后又進行測序比對，與報道的oqxA和oqxB基因耐藥質(zhì)粒的同源性分別是99%和100%，因此初步可以確定我們臨床分離的耐藥大腸桿菌oqxAB基因位于質(zhì)粒上，這種耐藥方式有質(zhì)粒介導(dǎo)，這與文獻報道oqxAB基因在質(zhì)粒上的研究是一致的。
　　 綜上所述，本試驗設(shè)計不同濃度喹賽多考察對模型中人腸道菌群的影響，

12、16μg/mL劑量組對腸道四種優(yōu)勢菌數(shù)量、大腸桿菌和腸球菌耐藥率、短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)、定植屏障指標(biāo)沒有影響；32、128μg/mL劑量組對腸道菌群指標(biāo)有不同程度的影響，16μg/mL濃度是不會對人腸道菌群有影響的，是一類較為安全的抗菌促生長劑。另外，32、128μg/mL劑量組大腸桿菌耐藥率的升高是藥物對固有耐藥大腸桿菌選擇作用，殺死敏感菌同時，固有耐藥菌過度生長繁殖所致的耐藥率的增加，而耐藥大腸桿菌中可以擴增出喹噁啉類耐藥