建立IHF小鼠模型研究阿莫西林對(duì)嬰兒腸道菌群的影響.pdf

1、抗生素處理是影響嬰兒腸道菌群定植的重要因素之一。臨床上許多廣譜抗生素作為兒科治療的常用藥物，具有減少腸道菌群多樣性等作用。直接利用嬰兒進(jìn)行腸道菌群研究存在倫理學(xué)限制，利用無(wú)菌動(dòng)物(germ free animal，GF動(dòng)物)構(gòu)建攜帶嬰兒腸道菌群的人源菌群動(dòng)物(infant human floral-assocciated animal，IHFA動(dòng)物)可以為研究抗生素處理對(duì)腸道菌群的影響提供了一個(gè)有效的模型。IHFA動(dòng)物模型已有初步的研究

2、和應(yīng)用，但缺乏對(duì)嬰兒腸道菌群在無(wú)菌動(dòng)物體內(nèi)的定植規(guī)律的系統(tǒng)研究，因此IHFA動(dòng)物模型是否適用于抗生素處理對(duì)嬰兒腸道菌群的影響未知。此外，由于目前國(guó)內(nèi)無(wú)菌動(dòng)物研究和服務(wù)水平較低，限制了IHFA模型的研究和應(yīng)用。因此，本研究擬建立無(wú)菌小鼠的自動(dòng)哺乳技術(shù)，為高效獲得無(wú)菌小鼠提供條件；利用無(wú)菌小鼠建立IHFA小鼠(infant humanfloral-assocciated mice)模型，研究小鼠年齡和品系因素對(duì)嬰兒腸道菌群定植的影響；利用I

3、HFA小鼠研究臨床劑量的阿莫西林處理對(duì)嬰兒腸道菌群的影響。
　　 方法
　　 1.為高效制備無(wú)菌小鼠，建立乳鼠自動(dòng)哺乳方法。對(duì)3日齡C57BL/6J小鼠實(shí)施微創(chuàng)胃瘺手術(shù)(n=48)，利用蠕動(dòng)泵將小鼠替代乳(mouse milk substitute，MMS)通過(guò)胃瘺泵入小鼠胃內(nèi)，利用相同日齡的母乳喂養(yǎng)乳鼠作為正常對(duì)照組(n=20)，觀測(cè)其生長(zhǎng)發(fā)育利用DGGE指紋圖譜技術(shù)評(píng)估其腸道菌群變化。將自動(dòng)哺乳方法應(yīng)用到無(wú)菌剖腹產(chǎn)獲

4、得的新生無(wú)菌昆明乳鼠，觀測(cè)其生長(zhǎng)發(fā)育及成年小鼠的血液生化指標(biāo)及繁殖能力。
　　 2.為研究嬰兒腸道菌群在無(wú)菌小鼠體內(nèi)的定植規(guī)律，將7日齡無(wú)菌乳鼠(昆明小鼠n=10；Balb/c小鼠，n=10)，接種3月齡健康母乳嬰兒糞便，建立IHFA小鼠模型。利用DGGE指紋圖譜技術(shù)及雙歧桿菌、乳桿菌的特異性引物qRT-PCR檢測(cè)postnatal day7(PND7)，PND14、PND21的IHFA小鼠腸道菌群，比較品系不同及不同年齡對(duì)嬰兒

5、腸道菌群在無(wú)菌小鼠體內(nèi)定植的影響。
　　 3.為研究抗生素對(duì)嬰兒腸道菌群的影響，將IHFA Balb/c小鼠自PND7至PND21灌胃阿莫西林(100mg/kg，n=10)或等量生理鹽水(n=10)。利用DGGE指紋圖譜技術(shù)及雙歧桿菌、乳桿菌的特異性引物qRT-PCR檢測(cè)PND21，PND53 IHFA小鼠腸道菌群，研究幼年阿莫西林對(duì)IHFA嬰兒腸道菌群的影響及成年后的恢復(fù)情況。
　　 結(jié)果
　　 1.改進(jìn)了乳鼠

6、的自動(dòng)哺乳技術(shù)，建立了快速制備無(wú)菌小鼠的方法。在自動(dòng)哺乳條件下，無(wú)菌小鼠和普通小鼠均可正常生長(zhǎng)發(fā)育。48只自動(dòng)哺乳11天后，37只C57BL/6J小鼠存活。腸道菌群V3-DGGE圖譜顯示，自動(dòng)哺乳與母乳喂養(yǎng)組條帶總數(shù)、shannon指數(shù)無(wú)顯著差異。然而兩組間少數(shù)DGGE條帶有明顯差異。上述結(jié)果提示，雖然對(duì)于3日齡C57BL/6J小鼠能成功進(jìn)行胃瘺手術(shù)并自動(dòng)哺乳存活，但自動(dòng)哺乳會(huì)導(dǎo)致腸道菌群發(fā)生改變。成功將乳鼠的自動(dòng)哺乳方法應(yīng)用于無(wú)菌乳鼠

7、，自動(dòng)哺乳21天后，無(wú)菌小鼠存活率可達(dá)62.5%，自動(dòng)哺乳獲得的無(wú)菌雌鼠產(chǎn)仔數(shù)量低于母乳喂養(yǎng)獲得的無(wú)菌雌鼠(P<0.05)。自動(dòng)哺乳獲得的無(wú)菌小鼠和母乳喂養(yǎng)獲得的無(wú)菌小鼠的生化指標(biāo)無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　 2.通過(guò)比較年齡和品系因素對(duì)嬰兒腸道菌群定植的影響，系統(tǒng)研究了嬰兒腸道菌群在無(wú)菌小鼠體內(nèi)的定植規(guī)律。Balb/c小鼠腸道菌群與人的相似性指數(shù)(Cs)顯著高于昆明小鼠(P<0.05)，兩組DGGE條帶有明顯差異，在聚類

8、分析和PCA圖中兩組能很好的分離。不同年齡的IHFA小鼠的DGGE條帶及與人的相似性指數(shù)(Cs)有明顯差異，在聚類分析和PCA圖中兩組能很好的分離。在PND7、14和21，昆明小鼠和Balb/c小鼠體內(nèi)雙歧桿菌和乳桿菌定植數(shù)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。乳桿菌數(shù)量隨小鼠年齡增長(zhǎng)而減少，但始終明顯高于人。雙歧桿菌數(shù)量隨小鼠年齡增長(zhǎng)而增加，但始終明顯低于人。
　　 3.通過(guò)阿莫西林處理組和正常對(duì)照組的比較，證明阿莫西林對(duì)嬰兒腸道菌群

9、有顯著影響，停止干預(yù)后至53日齡，仍不能完全恢復(fù)。在PND21的DGGE結(jié)果中，阿莫西林處理組與正常對(duì)照組shannon指數(shù)及均勻度差異顯著(P<0.05)，條帶數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)，在聚類分析和PCA圖中兩組能很好的分離；在PND53的DGGE結(jié)果中，阿莫西林處理組與正常對(duì)照組shannon指數(shù)及豐富度差異顯著(P<0.05)，均勻度無(wú)顯著差異(P>0.05)，在聚類分析和PCA圖中兩組均不能很好的分離；PND21阿莫西林處理

10、顯著降低腸道菌群中的雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量。在PND53，與正常對(duì)照組比較阿莫西林處理組均勻度、乳桿菌數(shù)量及雙歧桿菌數(shù)量均無(wú)顯著差異。
　　 結(jié)論
　　 1.通過(guò)改進(jìn)乳鼠自動(dòng)哺乳技術(shù)，建立了快速制備無(wú)菌小鼠的方法。對(duì)SPF及無(wú)菌乳鼠進(jìn)行胃瘺手術(shù)和自動(dòng)哺乳是可行的，乳鼠生長(zhǎng)發(fā)育正常，自動(dòng)哺乳獲得的成年無(wú)菌小鼠可正常繁殖獲得子代無(wú)菌小鼠，但自動(dòng)哺乳會(huì)導(dǎo)致攜帶正常菌群的乳鼠菌群紊亂。
　　 2.IHFA小鼠能部分模擬嬰兒

11、腸道菌群結(jié)構(gòu)，小鼠年齡和品系因素對(duì)嬰兒腸道菌群定植有顯著影響。在制備IHFA小鼠模型時(shí)，無(wú)菌小鼠的年齡和品系因素均可影響嬰兒腸道菌群定植。嬰兒腸道菌群在無(wú)菌小鼠體內(nèi)定植可一定程度的模擬嬰兒腸道菌群，但存在的差異不可忽視(如乳桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量差異)。
　　 3.阿莫西林處理可顯著改變IHFA乳鼠的嬰兒腸道菌群結(jié)構(gòu)，且成年后腸道菌群結(jié)構(gòu)未完全恢復(fù)正常。與文獻(xiàn)報(bào)道的臨床研究及動(dòng)物模型研究結(jié)果一致，提示IHFA小鼠是評(píng)價(jià)抗生素處理對(duì)