棉花中一個新的Parvulin類型肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶的功能分析.pdf

1、蛋白質(zhì)的正確折疊是其發(fā)揮生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。在細(xì)胞內(nèi)，分子伴侶及折疊酶可以幫助蛋白質(zhì)完成正確折疊。折疊酶主要包括肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPI)和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)。其中，PPI能通過催化肽酰脯氨酰鍵的異構(gòu)化加速并幫助蛋白質(zhì)的正確折疊。到目前為止，PPI的研究主要集中在哺乳動物和原核生物中，植物體內(nèi)的研究極少。作物在生長發(fā)育過程中通常會受到脅迫的影響，在逆境下，蛋白質(zhì)會因變性而導(dǎo)致生物功能的喪失，分子伴侶及折疊酶在維持蛋白質(zhì)天然構(gòu)

2、象方面起非常重要的作用。鹽脅迫是危害農(nóng)作物的主要非生物脅迫之一，鹽脅迫下會導(dǎo)致某些基因的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，對這些基因及其編碼蛋白的研究有助于闡明抗鹽機制并對提高作物抗鹽能力提供了理論依據(jù)。我們對前期篩選到的一個棉花鹽脅迫下表達(dá)上調(diào)的基因AY972810進(jìn)行功能分析研究，主要結(jié)果如下：
　　 (1)氨基酸序列同源性分析表明棉花耐鹽基因AY972810編碼的蛋白質(zhì)屬于PPI中的Parvulins家族。利用美國國立生物技術(shù)信息中心(NC

3、BI)數(shù)據(jù)庫，BLAST比對發(fā)現(xiàn)，該基因編碼包含140個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其中48-140位氨基酸之間即C末端具有parvulin類型的PPI結(jié)構(gòu)域。用SWISS-MODEL在線軟件工具進(jìn)行同源搜索，也發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白在41-140位氨基酸之間具有parvulin型結(jié)構(gòu)域保守區(qū)。根據(jù)兩個數(shù)據(jù)庫的同源分析，預(yù)測該蛋白屬于PPI中parvulin家族中的成員，我們將該基因編碼的蛋白質(zhì)命名為GhPPI。
　　 (2)同源蛋白聚類

4、分析表明GhPPI與AtPin2、LjPar2進(jìn)化距離比較近。為了確定GhPPI在parvulin家族中的位置，我們使用MEGA4.1軟件對同源性較高的20種生物中此類蛋白進(jìn)行聚類分析并繪制了進(jìn)化樹。結(jié)果表明，GhPPI和百脈根LjPar2同源性高達(dá)91％，與擬南芥AtPin2、水稻及玉米PPI同源性高達(dá)80％多。與人的hPar14及小鼠、變形蟲等中的PPI同源性也達(dá)到55％，表明該類蛋白在進(jìn)化上高度保守。除了C-端PPI酶結(jié)構(gòu)域高度保

5、守外，GhPPI的N-端富含Lys(K)，與人類的hPar14、hPar17的N端同源性比較高。
　　 (3)基因AY972810原核表達(dá)產(chǎn)物具有PPI酶活性。將該基因構(gòu)建到pET30a載體上并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)，在編碼蛋白的N末端添加His標(biāo)簽，利用His-tag親和層析的方法純化該蛋白。以含有脯氨酸的小肽為底物，分析該蛋白催化的肽酰脯氨酰鍵順反異構(gòu)轉(zhuǎn)換活性。結(jié)果表明該蛋白具有PPI活性，可以催化肽酰脯氨酰順反結(jié)構(gòu)之間

6、的轉(zhuǎn)換，且催化反應(yīng)的速度依賴于PPI濃度。根據(jù)我們對NCBI數(shù)據(jù)庫查找，這是植物中首次鑒定到的與鹽脅迫有關(guān)的parvulin家族PPI成員。
　　 (4)通過同源建模及分子對接推測了GhPPI的必需氨基酸殘基。利用分子模擬同源建模建立了GhPPI的三維空間結(jié)構(gòu)，與parvulin家族其他成員結(jié)構(gòu)域同源性比較找出了7個GhPPI對應(yīng)位置的保守氨基酸殘基；用autodock4.0分子對接軟件對GhPPI和底物進(jìn)行對接模擬，找出了Gh

7、PPI中可能參與底物結(jié)合及催化的氨基酸殘基，共11個，其中包括了用分子模擬同源建模預(yù)測的7個氨基酸殘基。這兩種方法推測的結(jié)果基本吻合。
　　 (5)通過化學(xué)修飾及定點突變的方法確定GhPPI的必需氨基酸。用專一性化學(xué)修飾法對可能的必需氨基酸進(jìn)行了初步檢測。結(jié)合同源建模、分子對接及化學(xué)修飾的結(jié)果，選擇了11個氨基酸位點，對編碼基因進(jìn)行了定位突變，經(jīng)原核表達(dá)和蛋白純化后，研究了不同位點對PPI活性的影響。其中5個位點氨基酸即H48、

8、H131、H134、F111和C90突變后，酶活性下降60％以上；2個位點氨基酸即M107和T130突變后，酶活性下降30％左右。以上結(jié)合化學(xué)修飾、結(jié)構(gòu)模擬及分子對接結(jié)果，我們認(rèn)為這7個氨基酸為GhPPI的活性必需氨基酸。
　　 (6)GhPPI也具有分子伴侶活性。GhPPI能抑制變性的肌酸激酶在稀釋復(fù)性過程中的聚沉，初步說明GhPPI具有分子伴侶活性。突變體PPI活性分析表明，C90、M107及H134位點突變后，抑制聚沉的能