果蠅中一個(gè)新基因ecp的功能鑒定與分析.pdf

1、本文從野生型黑腹果蠅胚胎cDNA文庫(kù)中篩選并克隆得到ecp全長(zhǎng)cDNA序列。生物信息學(xué)分析表明：ECP在進(jìn)化過(guò)程中是十分保守的，從果蠅、斑馬魚(yú)到哺乳動(dòng)物中均有其同源蛋白存在。從結(jié)構(gòu)方面來(lái)看，ECP在其氨基端帶有一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)基序，羧基端帶有一個(gè)elF5C結(jié)構(gòu)域。這一結(jié)構(gòu)域是elF5與elF2β的結(jié)合位點(diǎn)，因而ECP可能與eIF2β相互作用進(jìn)而參與翻譯過(guò)程。 RNA原位雜交及胚胎抗體染色的結(jié)果都表明：在果蠅胚胎中，ecp無(wú)論

2、在RNA水平上，還是在蛋白水平上都呈現(xiàn)廣泛表達(dá)和分布，沒(méi)有明顯的組織特異性。Western Blot結(jié)果表明，ECP在果蠅的胚胎、幼蟲(chóng)、蛹及成蟲(chóng)中都有持續(xù)的高表達(dá)。這些結(jié)果提示ecp可能是一個(gè)管家基因。GFP標(biāo)記分析及S2細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，ECP主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，推測(cè)其可能通過(guò)與elF2β相互作用而參與翻譯過(guò)程。 Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，ECP蛋白在果蠅中存在兩種遷移率不同的形式，ECP-S和ECP-F。從這兩

3、種形式在果蠅不同發(fā)育階段所呈現(xiàn)的切換規(guī)律，即：胚胎、蛹和成蟲(chóng)都主要表達(dá)電泳遷移率較慢的形式(ECP-s)，伴隨著果蠅胚胎孵化成幼蟲(chóng)時(shí)即開(kāi)始表達(dá)遷移率較快的形式(ECP-F)，并持續(xù)到三齡幼蟲(chóng)開(kāi)始蛹化時(shí)又逐漸被ECP-S替代，這些結(jié)果表明。ECP-F可能與幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。 通過(guò)免疫共沉淀分析發(fā)現(xiàn)多種核糖體大小亞基蛋白能被抗ECP單抗所沉淀。與此同時(shí)，蔗糖密度梯度離心的結(jié)果也表明：有部分ECP能與40S、60S核糖體亞基結(jié)合。

4、通過(guò)酵母雙雜交，我們找到了兩個(gè)可能與ECP相互作用的蛋白質(zhì)，elF2β和RPL5。這些結(jié)果表明ECP可能是一種核糖體相關(guān)蛋白，又因其可以和翻譯起始因子eIF2β相互作用，因而ECP可能在翻譯起始過(guò)程中起某種作用。 S35-Methionine摻入實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)RNAi抑制S2細(xì)胞中ECP的表達(dá)后，蛋白質(zhì)合成速率下降約45％。另一方面，在ecp的第一個(gè)內(nèi)含子帶有P因子插入突變的果蠅1(3)03022表現(xiàn)為短剛毛，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，翅