水牛TREM1和LBP基因shRNA干擾序列的篩選.pdf

1、在細(xì)菌脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中，髓樣觸發(fā)受體1(TREM1)的抑制將影響LPS的親和性受體CD14基因的表達(dá)；脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)的抑制將阻斷LPS與CD14的結(jié)合路徑。為了闡明布氏桿菌病發(fā)生相關(guān)基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，同時(shí)為利用RNA干擾技術(shù)培育抗布氏桿菌病轉(zhuǎn)基因動(dòng)物打下基礎(chǔ)，本研究對(duì)抑制水牛TREM1基因和LBP基因表達(dá)的shRNA干擾序列進(jìn)行了篩選。
　　 一、TREM1基因shRNA篩選與病毒感染水牛單核細(xì)胞的初步

2、研究
　　 1.克隆水牛和黃牛TREM1基因mRNA ORF全長(zhǎng)序列，構(gòu)建水牛TREM1基因融合蛋白表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)水牛TREM1基因在293細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，克隆得到的水牛和黃牛的TREM1基因ORF序列，兩者同源性為97.2％，重組質(zhì)粒pDsRed-N1-TREM1可在293細(xì)胞中表達(dá)。水牛TREM1基因序列成功提交到GenBank(JQ390222)。
　　 2.針對(duì)水牛T

3、REM1基因CDS序列，設(shè)計(jì)5個(gè)shRNA片段并構(gòu)建其慢病毒表達(dá)載體pSicoR-GFP-shTREM96/194/294/578/643，同時(shí)以無(wú)關(guān)序列pSicoR-1864(N-C)作為陰性對(duì)照。PCR和測(cè)序鑒定后，將水牛TREM1表達(dá)載體(靶質(zhì)粒)與其shRNA表達(dá)載體(干擾質(zhì)粒)分別以1:1和1:3的比例經(jīng)LipofectamineTM2000脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀和QRT-PCR方法檢測(cè)shRNA抑制效率。結(jié)果

4、發(fā)現(xiàn)，靶質(zhì)粒與干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染劑量比為1:1時(shí)，shTREM-194、shTREM-294和shTREM578抑制效率分別53.86％、49.27％和40.10％；1:3比例共轉(zhuǎn)染時(shí)，抑制效率分別為63.07％、79.24％和31.14％。
　　 3.從水牛外周血中分離單核巨噬細(xì)胞，用TREM1 shRNA慢病毒感染水牛單核巨噬細(xì)胞，通過(guò)QRT-PCR檢測(cè)TREM1和CD14基因的表達(dá)。結(jié)果表明，分離純化水牛單核巨噬細(xì)胞，可在體外培

5、養(yǎng)1周；TREM1和CD14基因在巨噬細(xì)胞中均有表達(dá)，CD14基因的表達(dá)量高于TREM1的表達(dá)。在未經(jīng)任何刺激情況下，shRNA病毒顆粒感染單核巨噬細(xì)胞的效率不高。
　　 二、LBP基因shRNA片段篩選
　　 1.克隆水牛和黃牛LBP基因，構(gòu)建其融合蛋白表達(dá)載體pDsRed-N1-LBP，并轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過(guò)QRT-PCR方法檢測(cè)水牛LBP基因在293細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別克隆得到的水牛、黃牛LBP基因序列，二

6、者同源性為98％。mRNA水平上檢測(cè)到LBP基因在293細(xì)胞中可表達(dá)。水牛LBP基因成功提交到GenBank(JQ390223)。
　　 2.針對(duì)水牛LBP CDS序列設(shè)計(jì)2條shRNA序列，并構(gòu)建其慢病毒表達(dá)載體，命名為pSicoR-GFP-shLBP774/1212，PCR和測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒，QRT-PCR檢測(cè)shRNA的抑制效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將水牛LBP基因表達(dá)載體(靶質(zhì)粒)與其shRNA表達(dá)載體(干擾質(zhì)粒)以1:3的比例經(jīng)

7、LipofectamineTM2000脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，shLBP-774，shLBP-1212抑制效率分別為49.53％，29.27％。
　　 以上結(jié)果表明，篩選得到3條抑制TREM1基因表達(dá)的shRNA序列shTREM194、shTREM294和shTREM578，其中shTREM194和shTREM294的抑制效率較高達(dá)到63.07％和79.24％。2條抑制LBP基因表達(dá)的shRNA序列shLBP774和shLBPl