喹噁啉類對(duì)敏感大腸桿菌基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響研究.pdf

1、喹噁啉類化合物(Quinoxalines)是一類人工合成的抗菌藥，均屬喹噁啉-1，4-二氧化物的衍生物，表現(xiàn)出很好的抗菌促生長效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)進(jìn)行了喹噁啉類的體外抑菌試驗(yàn)以及喹噁啉類對(duì)畜禽常見致病菌引發(fā)的疾病的預(yù)防效果研究，說明該類藥物的確具有有較強(qiáng)的抑菌效果，但是喹噁啉類化合物的抗菌機(jī)制至今未得到很好的揭示。目前只知道喹噁啉類化合物喹多辛的抗菌作用方式是抑制細(xì)菌的DNA合成，但是其真正的DNA損傷機(jī)制和抗菌靶點(diǎn)需要進(jìn)行更清楚深入的探

2、討?，F(xiàn)今，基因組和蛋白組學(xué)技術(shù)已成為研究藥物作用機(jī)理和靶點(diǎn)的新手段。本研究選取了喹噁啉類新藥喹賽多和對(duì)喹賽多敏感的大腸桿菌作為研究對(duì)象，喹乙醇作為喹噁啉同類藥物，通過基因芯片篩選出喹賽多和喹乙醇作用大腸桿菌前后的差異表達(dá)基因，分析與藥物作用相關(guān)的基因以及藥物對(duì)細(xì)菌生長繁殖、新陳代謝和毒力等多方面的影響，提出喹噁啉類藥物抗菌機(jī)理假設(shè)，并確定藥物可能的抗菌靶點(diǎn)。采用優(yōu)化的大腸桿菌雙向電泳-質(zhì)譜鑒定技術(shù)考察喹賽多和喹乙醇作用大腸桿菌前后的差異

3、蛋白，對(duì)差異基因結(jié)果提供補(bǔ)充和完善。對(duì)喹賽多和喹乙醇抗菌機(jī)理的研究將加快喹噁啉類藥物的研發(fā)速度，為該藥申報(bào)提供更全面的合乎國際和國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的資料，為日后的臨床用藥提供參考依據(jù)、為動(dòng)物和人類用藥安全提供保障。
　　 1.細(xì)菌的選擇和藥物作用濃度和時(shí)間的確定
　　 為了選擇合適的敏感菌，分別在厭氧和有氧條件下，采用微量肉湯稀釋法測(cè)定喹賽多和喹乙醇對(duì)動(dòng)物源致病性大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)以及最小殺菌濃度(MBC)。結(jié)果表明

4、在厭氧條件下喹賽多和喹乙醇對(duì)大腸桿菌C84010的MIC為1μg/mL和4μg/mL，有氧條件下MIC都為16μg/mL，較其他幾株菌C84010對(duì)喹賽多最為敏感，因此選擇這株病原菌作為研究對(duì)象。其中在厭氧條件下，喹賽多和喹乙醇的抗菌活性明顯提高，與已有文獻(xiàn)關(guān)于喹噁啉類化合物厭氧條件下抗菌活性更高的報(bào)道一致，說明在厭氧條件下探討喹噁啉類藥物的抗菌機(jī)制更有意義。
　　 為了找出與藥物作用直接相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)以及藥物濃度與基因變化

5、之間的劑量關(guān)系，使用活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定不同濃度藥物處理后細(xì)菌的生長曲線，結(jié)果表明0.5MIC的喹賽多和1MIC的喹乙醇作用后，細(xì)菌的生長減慢，但是曲線仍然呈上升趨勢(shì)；MBC的喹賽多和喹乙醇作用細(xì)菌30min后，90%的細(xì)菌死亡，因此確定藥物濃度分別為0.5MIC、MBC的喹賽多和1MIC、MBC的喹乙醇，藥物孵育時(shí)間為30min。
　　 2.喹賽多和喹乙醇作用大腸桿菌后的差異表達(dá)基因
　　 為了深入研究喹噁啉類藥物抗菌的分子

6、作用機(jī)制，按照上述結(jié)果，選擇用0.5MIC、MBC喹賽多和1MIC、MBC喹乙醇處理30min的大腸桿菌作為四個(gè)不同的藥物處理組，1%DMSO處理相同時(shí)間后的大腸桿菌作為對(duì)照組，用芯片方法篩選藥物作用后的差異表達(dá)基因，并對(duì)差異基因進(jìn)行功能分類和蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)分析。
　　 從0.5MIC的喹賽多作用后的大腸桿菌中篩選出25個(gè)差異基因，全部呈顯著的上調(diào)表達(dá)；從MBC的喹賽多作用后的大腸桿菌中篩選出55個(gè)差異基因，其中46個(gè)顯著上調(diào)，9個(gè)

7、顯著下調(diào)。從MIC的喹乙醇作用后的大腸桿菌中篩選出166個(gè)差異基因，68個(gè)基因呈顯著的上調(diào)，98個(gè)基因顯著下調(diào)表達(dá)：從MBC的喹乙醇作用后的大腸桿菌中篩選出102個(gè)差異基因，其中81顯著上調(diào)，21個(gè)顯著下調(diào)。
　　 這些差異基因可以分為7大類，包括SOS基因、細(xì)胞膜相關(guān)基因、細(xì)胞毒性相關(guān)基因、物質(zhì)合成代謝相關(guān)基因、細(xì)胞色素氧化酶基因、DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因和假定基因。其中四個(gè)藥物處理組共同引起DNA損傷修復(fù)SOS基因的上調(diào)表達(dá)，SO

8、S基因占0.5MIC喹賽多作用后差異基因的80%，且這些基因的變化倍數(shù)與藥物濃度之間存在明顯的劑量關(guān)系，表明喹賽多和喹乙醇對(duì)細(xì)菌的DNA有明顯的損傷作用。推測(cè)喹賽多和喹乙醇在厭氧條件下經(jīng)過還原代謝激活反應(yīng)產(chǎn)生的芳香族自由基中間體會(huì)作用于DNA核糖上的C1位，造成大腸桿菌內(nèi)DNA的斷裂損傷。MBC的喹賽多和喹乙醇對(duì)細(xì)菌DNA損傷后，大量細(xì)菌死亡，部分存活下來的細(xì)菌需啟動(dòng)抗應(yīng)激相關(guān)的調(diào)控基因(yjbJ，marA)，調(diào)控多種基因的表達(dá)以適應(yīng)環(huán)

9、境的急劇改變，如減慢蛋白質(zhì)合成速度(yafO)，關(guān)閉鞭毛的運(yùn)動(dòng)性(fliM)，減弱細(xì)胞膜運(yùn)輸物質(zhì)的功能(rbsC、proV和treB)等，同時(shí)引起外排泵基因(ydhC)的上調(diào)表達(dá)，將喹賽多和喹乙醇排出細(xì)菌外。
　　 3.喹賽多和喹乙醇作用大腸桿菌后的差異表達(dá)蛋白
　　 為了從蛋白質(zhì)翻譯水平補(bǔ)充和完善差異基因的結(jié)果，采用優(yōu)化的大腸桿菌雙向電泳方法，篩選喹賽多和喹乙醇作用細(xì)菌后的差異表達(dá)蛋白。差異蛋白的功能主要是與DNA修復(fù)

10、、抗氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)合成、細(xì)菌形態(tài)和細(xì)菌毒性等相關(guān)。LexA蛋白的下調(diào)表達(dá)與基因芯片結(jié)果中l(wèi)exA的上調(diào)表達(dá)相反，是基于LexA的自降解活性，LexA自剪切后激活SOS基因表達(dá)；在蛋白水平上發(fā)現(xiàn)了另外的抗氧化應(yīng)激蛋白Ssb和YgfZ上調(diào)表達(dá)，保護(hù)細(xì)菌DNA免受氧化損傷；蛋白質(zhì)合成延伸因子下調(diào)表達(dá)，與芯片結(jié)果中蛋白質(zhì)翻譯抑制基因的上調(diào)表達(dá)結(jié)果一致，推測(cè)細(xì)菌在藥物作用下，關(guān)閉蛋白質(zhì)合成直至恢復(fù)正常生長；另外決定大腸桿菌形態(tài)的MreB蛋白下調(diào)

11、，提示藥物作用后細(xì)菌形態(tài)的改變，與基因芯片結(jié)果中sulA上調(diào)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)菌成絲狀的現(xiàn)象一致。
　　 綜上所述，本研究采用基因芯片和雙向電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)大量DNA損傷修復(fù)基因和蛋白的差異表達(dá)，表明在厭氧條件下這兩種喹嗯啉類藥物通過還原激活反應(yīng)產(chǎn)生的中間體自由基對(duì)細(xì)菌DNA造成了嚴(yán)重?fù)p傷，從而發(fā)揮抗菌作用。同時(shí)藥物對(duì)細(xì)菌DNA產(chǎn)生的損傷作用，直接或間接地影響了細(xì)菌各個(gè)方面的正常代謝活動(dòng)。因此，本課題的研究成果為進(jìn)一步研究喹噁啉類藥物的抗菌