喹噁啉類遺傳毒性分子機(jī)制.pdf

1、喹噁啉類化合物具有共同的喹噁啉-1，4-二氮氧基本結(jié)構(gòu)，主要有卡巴氧(Carbadox，CBX)、喹乙醇(Olaquindox，OLA)、乙酰甲喹(Mequindox，MEQ)、喹烯酮(Quinocetone，QCT)和喹賽多(Cyadox，CYA)。該類化合物具有明顯的抗菌促生長作用，被廣泛用作飼料添加劑和生長促進(jìn)劑?？ò脱鹾袜掖家蚓哂袧撛诘闹禄⒅掳┮约爸峦蛔兲匦?，被歐盟禁止用于畜禽飼料添加劑中。乙酰甲喹、喹烯酮為我國自主研制的新

2、型喹噁啉藥物，但有研究報道乙酰甲喹和喹烯酮能夠損傷DNA?？ò脱?、喹乙醇、喹烯酮和乙酰甲喹具有一定的遺傳毒性效應(yīng)，但是對于該類化合物遺傳毒性分子機(jī)理并不清楚。研究普遍認(rèn)為，該類化合物致DNA損傷是和自由基(ROS)密切相關(guān)，然而對于ROS的來源、種類以及ROS與DNA損傷的關(guān)系并不清楚。另外是否還存在有其它DNA損傷機(jī)理，也缺少相關(guān)研究資料。該類化合物遺傳毒性共同點(diǎn)是能夠引起哺乳動物細(xì)胞DNA發(fā)生斷裂。本課題從ROS與DNA損傷、藥物與

3、DNA結(jié)合作用、拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topoisomerase，Topo)活性以及DNA復(fù)制與損傷修復(fù)酶基因表達(dá)四個角度入手，研究該類化合物致DNA損傷的分子機(jī)理。主要研究內(nèi)容包括：
　　 ⑴篩選遺傳毒性最強(qiáng)藥物、最敏感細(xì)胞來確定研究材料:通過MTT法和彗星實(shí)驗(yàn)(SCGE)分別從細(xì)胞生長抑制和DNA斷裂損傷兩個方面來篩選敏感細(xì)胞和遺傳毒性最強(qiáng)藥物。結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞對該類藥物誘導(dǎo)下的生長抑制和DNA斷裂損傷最為明顯，喹烯酮致DNA

4、斷裂損傷作用最強(qiáng)。因此確定HepG2細(xì)胞和喹烯酮作為該類化合物遺傳毒性分子機(jī)制研究材料。20μM喹烯酮可以顯著增加HepG2細(xì)胞DNA斷裂損傷。
　　 ⑵研究喹烯酮作用HepG2細(xì)胞所產(chǎn)生ROS的來源、種類以及與DNA損傷的關(guān)系:使用超氧陰離子自由基熒光探針檢測ROS的種類，凝膠電泳法和線粒體DNA損傷檢測來尋找ROS的來源。發(fā)現(xiàn)喹烯酮20μM以上均能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基(O2·-)和羥基自由基(OH·)來損傷DN

5、A，并且具有明顯的時間和劑量依賴性效應(yīng)關(guān)系;喹烯酮能夠在黃嘌呤氧化酶(XOR)作用下代謝產(chǎn)生O2·-，這些ROS可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成毒性更強(qiáng)的氫過氧自由基(HOO·)和OH·來損傷膜結(jié)構(gòu)、酶系統(tǒng)以及核苷酸;SOD能夠明顯減輕喹烯酮誘導(dǎo)的DNA損傷;喹烯酮又可以引起線粒體DNA上細(xì)胞色素C氧化酶亞單位1(COX1)、細(xì)胞色素C氧化酶亞單位3(COX3)和ATP合成酶亞單位6(ATP6)基因發(fā)生突變，突變的基因造成更多ROS的產(chǎn)生。
　　

6、 ⑶喹烯酮對拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性影響:瓊脂糖凝膠電泳法檢測喹烯酮作用HepG2細(xì)胞后的核提取物拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性，發(fā)現(xiàn)40μM喹烯酮能夠抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ去連環(huán)反應(yīng)的活性，而對拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ沒有影響。體外體系研究發(fā)現(xiàn)，喹烯酮也可以抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ斷裂后的再連接作用，使HepG2細(xì)胞產(chǎn)生穩(wěn)定的DNA-TopoⅡ斷裂復(fù)合物，引起DNA的斷裂。
　　 ⑷喹烯酮與DNA結(jié)合作用研究:采用紫外吸收光譜法和高效液相色譜法來研究喹烯酮與

7、DNA的結(jié)合作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)40μM以上劑量的喹烯酮均能夠和DNA發(fā)生非共價的溝槽或者靜電結(jié)合，而不能發(fā)生共價結(jié)合。這種結(jié)合可能會阻止DNA復(fù)制過程中拓?fù)洚悩?gòu)酶的移動，形成穩(wěn)定的喹烯酮-DNA-TopoⅡ斷裂復(fù)合物而造成DNA的斷裂。
　　 ⑸熒光定量PCR法檢測喹烯酮對DNA復(fù)制和修復(fù)關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響:發(fā)現(xiàn)30μM喹烯酮作用HepG2細(xì)胞后DNA損傷誘導(dǎo)因子(Gadd45)、細(xì)胞增殖抗原(PCNA)和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(TopoⅡ

8、)基因表達(dá)水平均受到明顯影響。其中Gadd45基因表達(dá)倍數(shù)上調(diào)2倍以上。TopoⅡ和PCNA基因表達(dá)均下調(diào)，其中TopoⅡ基因在喹烯酮20μM劑量下作用2h表達(dá)就受到明顯抑制，下調(diào)倍數(shù)在2倍以上。這種抑制效應(yīng)能夠被SOD減弱。
　　 ⑹喹噁啉類遺傳毒性分子機(jī)理有以下幾個方面：黃嘌呤氧化還原酶作為喹烯酮毒性作用的原發(fā)靶點(diǎn)，能夠?qū)⑵浯x產(chǎn)生超氧陰離子自由基和羥基自由基;代謝產(chǎn)生的ROS攻擊胞漿中DNA合成原料鳥嘌呤、生物體膜系統(tǒng)以及

9、抗氧化酶系統(tǒng)，使DNA合成原料供給障礙、脂質(zhì)過氧化而產(chǎn)生DNA加合作用敏感物質(zhì)MDA、改變膜的通透性、降低機(jī)體防御能力;穿過屏障系統(tǒng)的ROS更易攻擊線粒體DNA和核DNA，造成DNA斷裂、突變等多種毒性后果，這是該類化合物毒性作用主要機(jī)理。機(jī)體損傷嚴(yán)重情況下，喹烯酮更易透過屏障通過自由擴(kuò)散作用進(jìn)入核內(nèi)和線粒體內(nèi)與DNA發(fā)生作用，抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶活性，造成DNA斷裂損傷，這是該類化合物毒性反應(yīng)又一原發(fā)作用機(jī)理。線粒體DNA損傷后，繼發(fā)產(chǎn)生更