家蠶暗化型(mln)與石蠶(st)突變體的定位克隆及其候選基因的功能研究.pdf

1、家蠶不僅是重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)昆蟲；其適中的身型，較短的生長周期，較高的繁殖率等先天優(yōu)勢與完備的基因組數(shù)據(jù)，分子標(biāo)記連鎖圖譜，遺傳變異圖譜以及百余年經(jīng)典遺傳學(xué)研究所積累的大量突變資源使之成為鱗翅目的模式生物。家蠶突變基因資源的類型眾多，涉及體色，軀體附肢發(fā)育，體型體態(tài)，變態(tài)發(fā)育，氨基酸代謝，尿酸鹽代謝，卵色卵型，致死等；同時，已記載的孟德爾突變超過450個，其中約300余個突變被定位于家蠶各連鎖群。如此豐富的突變資源在養(yǎng)蠶繅絲業(yè)，家蠶基礎(chǔ)生物

2、學(xué)研究的模式動物化，家蠶生物反應(yīng)器，甚至是生物學(xué)基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域扮演著重要的角色。
　　 家蠶突變體中所占比例非常大的兩個類群是體色和體型突變。在鱗翅目昆蟲中，體色和體型模式對其生存和繁衍具有重要的意義。研究家蠶體色和體型突變體的形成機(jī)制不僅有助于理解鱗翅目昆蟲色素及形態(tài)發(fā)育的代謝和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還能夠為家蠶功能基因的利用(如家蠶實用種的育種應(yīng)用或鱗翅目害蟲防治)提供思路。因此，我們選擇家蠶代表性黑化突變暗化型及幼蟲體型代表性突變石蠶

3、作為研究對象，利用定位克隆技術(shù)分離這兩個突變體的候選基因，并對候選基因進(jìn)行相關(guān)的功能研究。所取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.暗化型和石蠶突變體的分子定位及候選基因篩查
　　 我們利用SSR分子標(biāo)記對mln和st位點進(jìn)行了初步定位，分別獲得了包含mln和st位點的分子標(biāo)記連鎖圖譜。其中，標(biāo)記S1807與mln位點緊密連鎖；與st位點最近的標(biāo)記S0809雖然與其圖距為49.6cM，但是整張圖譜中其他標(biāo)記之間的相對位置及距

4、離與他們在基因組上的位置和間距吻合，適于進(jìn)行對st位點的進(jìn)一步分析。根據(jù)分子連鎖圖中突變基因所在位點與其最近分子標(biāo)記間的距離和家蠶分子連鎖圖譜與物理圖譜中圖距的對應(yīng)關(guān)系進(jìn)行換算，推測突變基因大概所在的基因組物理位置，并結(jié)合生物信息學(xué)分析篩查候選區(qū)域內(nèi)可能的候選基因。對于mln來說，在候選區(qū)域內(nèi)，我們關(guān)注一個預(yù)測基因BGIBMGA008538。該基因在果蠅中的同源體AANAT1能夠催化多巴胺等單胺類物質(zhì)，而多巴胺為黑色素的前體物質(zhì)，同時該

5、基因的組織芯片數(shù)據(jù)顯示其在幼蟲頭部高表達(dá)，而頭部是mln表型最明顯的部位；時期芯片數(shù)據(jù)顯示該基因在蛹后期及蛾期高量表達(dá)，而mln突變在蛹后期至蛾期明顯黑化，若mln中BGIBMGA008538基因功能缺失，存在的無法消耗多巴胺的可能性時，便有可能導(dǎo)致多巴胺過量累積，而形成黑化；另外，基于該預(yù)測基因的基因組片段所設(shè)計的多態(tài)性標(biāo)記P3C在定位群體中的分型結(jié)果顯示其與mln位點間沒有發(fā)生重組；進(jìn)一步的，對P3C的測序結(jié)果顯示，在mln中，預(yù)測

6、基因BGIBMGA008538的第三外顯子存在序列缺失，所以我們將BGIBMGA008538確定為mln突變的候選基因。對于st突變來說，我們通過遺傳圖距與物理圖距的換算，推算最近標(biāo)記S0809與st位點相距約為14.88Mb，并結(jié)合分子圖譜中標(biāo)記間的排序，標(biāo)記所在位置，家蠶第8號染色體物理圖譜中scaffold和gap的長度，我們推測st位點可能落在nscaf2827。進(jìn)一步關(guān)聯(lián)st的表型，我們推測st突變可能與表皮蛋白相關(guān)。我們對n

7、scaf2827上三個預(yù)測的表皮蛋白基因進(jìn)行芯片分析，基因分型分析及RT-PCR分析，結(jié)果顯示，預(yù)測基因G2在幼蟲期較為特異的表達(dá)；該基因與st位點間沒有發(fā)生重組且基于其cDNA序列的擴(kuò)增產(chǎn)物在野生型與st突變中差異明顯。因此，我們將G2基因確定為st突變的候選基因。
　　 2.暗化型和石蠶突變體候選基因的克隆及其在野生型與突變中的序列差異分析
　　 我們克隆了mln與st突變候選基因的全長cDNA及差異所在的基因組序列

8、，并且分析比較它們在野生型與突變中的差異。結(jié)果顯示：野生型大造的cDNA擴(kuò)增出一條1460bp的片段，而mln突變中擴(kuò)增出兩條片段，分別為1407bp和1253bp。我們將此3條轉(zhuǎn)錄本的測序結(jié)果結(jié)合前章大造與大造mln中P3C擴(kuò)增片段的測序結(jié)果聯(lián)合分析，結(jié)果表明：突變型缺失了96bp的外顯子(67bp)內(nèi)含子混合序列，同時又插入了29bp的內(nèi)含子序列。大造中的Bm-iAANAT有5個外顯子并編碼261個氨基酸殘基，具有完整的乙酰基轉(zhuǎn)移酶

9、結(jié)構(gòu)域。大造-mln中的第一種異常的轉(zhuǎn)錄本type-1的cDNA缺少除前2bp以外的整個第4外顯子，并移碼形成了提前終止密碼TAG。第二種異常轉(zhuǎn)錄本Type-2缺少第4外顯子的后67bp，另外插入了15bp的內(nèi)含子序列。Type-2的終止密碼子位于正常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’UTR處。所以，type-1與type-2都編碼了潛在的異常蛋白質(zhì)，與野生型相比，均破壞了乙酰轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域。st突變的候選基因Bm-st全長547bp，包含4個外顯子，其中5’

10、UTR為38bp，3’UTR，為77bp。編碼143個氨基酸，具有典型的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。而在st突變中存在58bp的缺失及6處單堿基替換，并有移碼產(chǎn)生。突變后的Bm-st的幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)域被完全破壞，功能上存在潛在缺失性。
　　 3.mln候選基因的表達(dá)模式及其在野生型與突變中的表達(dá)差異分析
　　 mln突變的候選基因Bm-iAANAT基因的時期表達(dá)分析從4齡第3天幼蟲開始到羽化結(jié)束。RT-PCR分析顯示Bm-iAANAT

11、的表達(dá)水平在該發(fā)育時期具有波動性。在4齡第3天(蛻皮間期)時表達(dá)正常，在第4次蛻皮階段開始時(0-16小時)停止表達(dá)，蛻皮階段后(24小時后)表達(dá)重新開始。在5齡起蠶階段的大部分時間表達(dá)量相對較高，在剛上蔟時沒有檢測到表達(dá)。在上蔟末期(W2.5天)，與20E的滴度呈負(fù)相關(guān)，Bm-iAANAT的表達(dá)量顯著上升(32)。最高表達(dá)量出現(xiàn)在化蛹后的第7天(P7)與第8天(P8)。組織表達(dá)模式的結(jié)果顯示，Bm-iAANAT基因在幼蟲頭部，絲腺和體

12、壁中表達(dá)豐度高。尤以頭部的表達(dá)量為最高。Bm-iAANAT基因的表達(dá)量在其它組織中十分低或幾乎檢測不到。Bm-iAANAT基因在家蠶不同骨化程度部位的表達(dá)模式顯示：Bm-iAANAT基因在高度骨化的組織(頭，胸足和肛板)中的表達(dá)量比在低度骨化組織(表皮)中高。也就是說，Bm-iAANAT的高表達(dá)量與mln突變型蠶體中的黑色部位有關(guān)，而與非黑色部位無關(guān)。5齡第4天，化蛹第2天和羽化時期大造-mln與大造中Bm-iAANAT的半定量結(jié)果顯示

13、：mln中的兩種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)量比大造中正常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)量要低；定量PCR結(jié)果表明，在野生型家蠶體中正常Bm-iAANAT的表達(dá)量為mln突變體中兩種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)量之和的10-20倍。另外，在能夠表現(xiàn)出mln與大造表型差異的部位(頭，胸足和肛板)中，Bm-iAANAT的表達(dá)量仍然是大造高于mln突變體。
　　 4.st候選基因的表達(dá)模式，在野生型與突變中的表達(dá)差異以及蛻皮激素對該候選基因表達(dá)量的影響
　　 st突變的候

14、選基因Bm-st基因在4齡及5齡幼蟲食桑期均維持較高的表達(dá)量；在4齡剛眠時幾乎不表達(dá)；且該基因自蛹2天后表達(dá)量明顯下調(diào)。主要表現(xiàn)為幼蟲及蛹前期表達(dá)。組織表達(dá)模式顯示Bm-st在幼蟲的頭部，體壁，脂肪體，氣管高表達(dá)，其他組織表達(dá)量非常弱或幾乎檢測不到。Bm-st基因的時空表達(dá)模式與盯突變只在幼蟲期出現(xiàn)表型，且出現(xiàn)表型的部位為表皮相吻合。利用20E處理家蠶后，我們發(fā)現(xiàn)，處理3小時后，處理組Bm-st基因的表達(dá)量已經(jīng)低于對照組(半定量及定量結(jié)

15、果)，處理24小時后，處理組已經(jīng)發(fā)育為老熟幼蟲，Bm-st基因的表達(dá)量明顯低于對照組(半定量及定量結(jié)果)，這表明蛻皮激素對Bm-st基因的表達(dá)具有抑制作用。
　　 5.黑色素代謝關(guān)鍵基因在mln與野生型中的差異分析及Bm-iAANAT基因的功能研究
　　 我們詳細(xì)比較了黑色素代謝途徑中的關(guān)鍵基因在已著色的野生型與mln.突變頭部，胸足，肛板中的差異，結(jié)果顯示，在這些部位中Pale，Ddc和Yellow3個基因的表達(dá)量在大

16、造中高于在大造-mln中。但是，除頭部以外，ebony基因的表達(dá)量在大造中低于在大造-mln中。根據(jù)Ddc基因的在突變中的表達(dá)模式，我們推測mln中因Bm-iAANAT基因功能缺失而累積的大量多巴胺壓抑Ddc基因的表達(dá)，并通過野生型與突變中多巴胺的定量分析證實了推測。Bm-iAANAT基因的RNAi結(jié)果顯示，干涉組中約有20％的個體體色明顯黑化，且其Bm-iAANAT基因的表達(dá)量明顯低于對照組，表明Bm-iAANAT基因的確參與多巴胺的

17、消耗及家蠶的著色。本論文的研究第一次報道了AANAT類基因在昆蟲體色模式的形成中扮演著重要角色。
　　 6.兒茶酚胺類物質(zhì)與黑色素基因的相互作用對mln突變鞣化部位著色方式及物理性質(zhì)的影響
　　 我們詳細(xì)比較了不同發(fā)育階段野生型與mln突變體中黑色素代謝基因的表達(dá)及兒茶酚胺類物質(zhì)的含量，并比較了它們在野生型與突變體中的差異。結(jié)果表明，突變多巴胺、NBAD與Ddc，ebony，black及tan基因的相互調(diào)控與AANAT基

18、因的缺失，使得mln突變在不同發(fā)育階段按照既定的模式著色。我們在mln突變中注射β-丙氨酸后，改變mln中固有的色素代謝模式，成功反轉(zhuǎn)了mln的黑化表型，并進(jìn)行了相關(guān)色素物質(zhì)前提及基因的檢測。掃描電鏡對野生型與mln突變體成蟲背板截面的觀察結(jié)果顯示，mln的背板明顯出現(xiàn)分層狀結(jié)構(gòu)，這與mln中缺乏交聯(lián)物質(zhì)NADA有密切關(guān)系。野生型與突變體成蟲翅膀的機(jī)械性能顯示，mln翅的彈性模量明顯高于野生型，而阻尼性則明顯低于野生型，由于是利用近等位

19、基因系及進(jìn)行分析，因此野生型與突變體翅膀機(jī)械性能的不同主要是由于兩者間不同的兒茶酚胺代謝所造成的。
　　 7.野生型與st突變表皮中幾丁質(zhì)的測定、Bm-st基因的RNAi及原核表達(dá)研究
　　 st突變與野生型幼蟲盛食期表皮幾丁質(zhì)(N-乙酰葡萄糖胺)含量的測定結(jié)果顯示：st突變中葡萄糖胺的含量為385.95±55.04119μg/mg，野生型中的含量為525.28±38.25767μg/mg。st突變中葡萄糖胺的含量的確是

20、低于野生型。這可能與Bm-st基因的功能缺失或不足有關(guān)。我們根據(jù)Bm-st的表達(dá)模式選定幼蟲4齡減食期為注射時期，注射后5齡剛蛻皮的時候觀察表型。結(jié)果顯示，干涉組約有41.1％的個體無法完成蛻皮，且這些個體體壁明顯緊繃，手觸有堅硬感，與st突變的表型較類似；極端個體表皮異常，影響體形甚至全身滲血黑化。分子檢測的結(jié)果顯示，干涉組有表型的個體Bm-st基因的表達(dá)量顯著低于對照組。為了研究野生型與突變中正常與異常的Bm-st蛋白與幾丁質(zhì)的結(jié)合