山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離及成肌調(diào)節(jié)因子的克隆、表達(dá)與功能初探.pdf

1、成肌調(diào)節(jié)因子（Myogenic regulatory factors, MRFs）屬于bHLH型蛋白，是目前公認(rèn)的骨骼肌發(fā)生的最主要調(diào)控因子，其生物學(xué)活性保證了機(jī)體骨骼肌細(xì)胞的正常發(fā)育，同時(shí)也與肉用動(dòng)物的生產(chǎn)性能息息相關(guān)。這類調(diào)節(jié)因子由兩個(gè)亞族構(gòu)成，一類是由MyoD1和Myf5構(gòu)成，參與胚胎發(fā)育時(shí)期成肌細(xì)胞的激活、發(fā)生，屬于成肌決定因子(determination-classMRFs);另一類負(fù)責(zé)成肌細(xì)胞的分化、融合，屬于成肌分化因子（

2、differentiation-class MRFs），其中典型的為MyoG。目前，關(guān)于MRFs家族的生物學(xué)功能的研究主要集中在小鼠和人類，對(duì)羊MRFs的報(bào)道甚少。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)克隆成肌決定因子亞族典型成員MyoD1和成肌分化因子亞族典型成員MyoG，構(gòu)建體外真核表達(dá)載體采用異位表達(dá)的方式驗(yàn)證其表達(dá)活性與成肌活力，并通過(guò)睪丸注射法制備轉(zhuǎn)基因肉羊，最終獲得MyoD1和MyoG過(guò)表達(dá)肉羊，對(duì)轉(zhuǎn)基因肉羊新品種的創(chuàng)制提供參考或育種素材。主要研究?jī)?nèi)

3、容如下:
　　1.骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離及其成肌分化根據(jù)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的獨(dú)特生理位置，對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離方法加以改進(jìn)，經(jīng)肌絲分離、細(xì)胞釋放和差速貼壁純化等步驟獲得了高純度的衛(wèi)星細(xì)胞。經(jīng)間接免疫熒光鑒定顯示:92.5±3.4％的細(xì)胞為Pax-7+細(xì)胞，93.0±1.8％的細(xì)胞為MyoD+細(xì)胞，表明SMSC純度在90％以上;經(jīng)生長(zhǎng)速度測(cè)定顯示SSC具有較快的生長(zhǎng)速度，呈典型的“S”型生長(zhǎng);通過(guò)比較成肌誘導(dǎo)體系Ⅰ、Ⅱ的成肌效果，發(fā)現(xiàn)無(wú)血

4、清培養(yǎng)基具備更佳的誘導(dǎo)效果，并對(duì)成肌誘導(dǎo)體系Ⅱ誘導(dǎo)24 h后gSMSC進(jìn)行IFA鑒定，結(jié)果顯示其Desmin陽(yáng)性率為92.3±1.1％，MyHC陽(yáng)性率為93.0±1.2％，表明誘導(dǎo)至24 h時(shí)有92％的細(xì)胞進(jìn)入成肌分化過(guò)程。
　　2.MyoD1與MyoG基因的克隆及生物信息學(xué)分析采用TriZol法提取成肌誘導(dǎo)分化24 h gSMSC總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，通過(guò)設(shè)計(jì)MyoD1、MyoG特異性引物，利用PrimeSTARMax DNA p

5、olymerase系統(tǒng)PCR體外克隆山羊MyoD1和MyoG基因的完整CDS，經(jīng)T-A克隆后遞交上海Invitrogen進(jìn)行測(cè)序分析。根據(jù)測(cè)序結(jié)果與綿羊、牛、豬、人和鼠進(jìn)行同源比較，結(jié)果表明MyoD1、MyoG基因克隆成功，MyoD1和MyoG基因在物種之間有較高同源性，其與綿羊的編碼氨基酸同源性均為100％。通過(guò)在線工具分析顯示MyoD1和MyoG蛋白均不含信號(hào)肽，是細(xì)胞核定位的疏水性蛋白;經(jīng)NCBI-CCD分析顯示MyoD1、Myo

6、G均含有典型的bHLH結(jié)構(gòu)，此外MyoD1蛋白還含有Myf5亞族（成肌決定因子亞族）典型結(jié)構(gòu)。
　　3.過(guò)表達(dá)MyoD1基因山羊皮膚成纖維細(xì)胞系建立及其成肌誘導(dǎo)分化研究采用組織貼壁法分離山羊皮膚成纖維細(xì)胞（goat skin fibroblast，GSF），并構(gòu)建pEGFP-MyoD1真核表達(dá)載體。采用LipofectaminTM LTX旨質(zhì)體介導(dǎo)pEGFP-MyoD1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GSF，通過(guò)400μg/mL的G418連續(xù)14 d的篩

7、選后，采用IFA檢測(cè)MyoD1和Myf5的表達(dá);采用成肌誘導(dǎo)培養(yǎng)對(duì)MyoD1異位表達(dá)GSF細(xì)胞株進(jìn)行成肌誘導(dǎo)分化，在分化處理2-3 d時(shí)采用IFA檢測(cè)MyoG、Desmin和MyHC等成肌分化早期標(biāo)志，結(jié)果顯示細(xì)胞90％以上細(xì)胞進(jìn)入成肌分化狀態(tài)。表明MyoD1基因的異位表達(dá)能夠誘導(dǎo)GSF等細(xì)胞向成肌方向分化。
　　4.MyoG真核表達(dá)載體的構(gòu)建與基因免疫法制備anti-MyoG血清利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建MyoG真核表達(dá)載體pcDN

8、A3.0-MyoG和真核融合表達(dá)載體pEGFP-MyoG。pcDNA3.0-MyoG經(jīng)PEI按1μg∶1.5μg包裹形成質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物后，按100μg/只的劑量肌肉注射小鼠股四頭肌，在第一次基礎(chǔ)免疫和三次加強(qiáng)免疫后采用眼球采血法收集抗血清。抗血清經(jīng)IFA鑒定其抗體效價(jià)，并與anti-eGFP比較共同檢測(cè)eGFP-MyoG融合蛋白以確定其抗體特異性，結(jié)果顯示抗血清能夠特異性識(shí)別MyoG蛋白，可用于后續(xù)試驗(yàn)檢測(cè)。
　　5.睪丸注射

9、法制備轉(zhuǎn)MyoD1綿羊和轉(zhuǎn)MyoG基因山羊質(zhì)粒(pEGFP-MyoD1或pEGFP-MyoG)經(jīng)線性化后，與PEI以1∶2的比例形成質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物，按每側(cè)睪丸300μL（100μg）的劑量進(jìn)行注射，在第二次加強(qiáng)注射10d后，進(jìn)行配種。配種完成后解剖獲得小鼠睪丸用于體視熒光顯微鏡觀察，顯示質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物注射處理的小鼠附睪管中含有綠色熒光物質(zhì)，過(guò)精子涂片顯示精子活動(dòng)劇烈，且精子頭部含有大量綠色熒光物質(zhì)。同睪丸注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠一樣

10、，采用隨機(jī)打點(diǎn)注射的方法按3 mg質(zhì)粒/（側(cè)·只）的劑量對(duì)湖羊（或徐淮山羊）進(jìn)行睪丸注射，其中，pEGFP-MyoD1-PEI復(fù)合物注射處理湖羊公羊睪丸，pEGFP-MyoG-PEI復(fù)合物注射處理徐淮山羊。在第一次注射7天后加強(qiáng)注射一次，加強(qiáng)注射40d后與母羊進(jìn)行自然交配。睪丸注射法制備轉(zhuǎn)基因湖羊和山羊，第一代累計(jì)獲得4只轉(zhuǎn)MyoD1-eGFP基因湖羊，陽(yáng)性率6.7％(4/59);獲得13只轉(zhuǎn)eGFP-MyoG基因山羊，陽(yáng)性率21.67