新生大鼠骨骼肌肌源性干細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)和鑒定.pdf

1、目的:肌源性干細(xì)胞(musclederived-stemcells，MDSCs)移植治療壓力性尿失禁(SUI)的研究深受關(guān)注，傳統(tǒng)的治療方法長(zhǎng)期療效不理想且并發(fā)癥多，隨干細(xì)胞研究的深入，干細(xì)胞移植成為肌肉組織損傷修復(fù)的一種重要手段，同時(shí)也為SUI的根本治療帶來(lái)希望。其中MDSCs倍受關(guān)注，它是肌肉中一種高度未分化的多潛能干細(xì)胞，具有體外分裂增殖快、自我更新、多向分化潛能和移植后存活率高等特點(diǎn)。并且取材資源豐富，操作方便，安全性高，是一種

2、理想的種子細(xì)胞。由于肌肉組織中MDSCs數(shù)量少，所以MDSCs的分離和體外培養(yǎng)是進(jìn)行移植的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用改良酶消化法和差速貼壁法分離純化出MDSCs，通過(guò)細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行鑒定，并對(duì)其體外培養(yǎng)進(jìn)行密切觀察，掌握穩(wěn)定的分離純化和培養(yǎng)方法，為將來(lái)移植治療SUI提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1骨骼肌細(xì)胞的消化分離:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為清潔級(jí)新生SD(Sprayue-Dawley)大鼠，雌雄不限。75％酒精浸泡窒息處死

3、后，取下四肢骨骼肌并剪成碎塊（約1mm3），PBS緩沖液吹打沖洗，靜置后去除上清液，加入約2倍體積的混合酶（2.4u/mlDispaseⅡ、0.5％Ⅰ型膠原酶，2.5mmol/LCaCl2），37℃水浴箱消化約1小時(shí)，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基終止消化，過(guò)濾后離心棄上層液，重懸細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)(37℃，5％CO2)。
　　 2MDSCs的分離、純化和培養(yǎng):培養(yǎng)2小時(shí)后貼壁細(xì)胞記為PP1，將上層液中未貼壁的細(xì)胞吸出后繼續(xù)培養(yǎng)。24小時(shí)后，貼壁細(xì)

4、胞記為PP2。每24小時(shí)進(jìn)行差速貼壁培養(yǎng)，直到獲得PP6。PP6培養(yǎng)3天后換液，每2～3天換液1次，待70～80％融合后傳代培養(yǎng)。用0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞，加入胎牛血清終止消化，按1∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
　　 3MDSCs生長(zhǎng)曲線的測(cè)定:取MDSCs傳代培養(yǎng)的一代、四代和七代細(xì)胞，0.25％胰酶消化后，以3×104個(gè)/ml的密度接種于24孔培養(yǎng)板，每日隨機(jī)選取3孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，共記錄8日，取平均值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

5、>　　 4MYY比色法觀察不同接種密度對(duì)MDSCs生長(zhǎng)的影響:取MDSCs傳代細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度分別為2、4、6、8、10、12、15×105個(gè)/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加入20ulMTT(5mg/ml)，37℃避光培養(yǎng)4小時(shí)后棄上清液，每孔加入100ul二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10分鐘使結(jié)晶物完全溶解，在490nm處檢測(cè)吸光度值。
　　 5MDSCs的鑒定:對(duì)獲取的MDSCs(PP6)以及MDSC

6、s傳一代、四代、七代進(jìn)行Desmin、Sca-1抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色，對(duì)PP1～PP6進(jìn)行Desmin免疫細(xì)胞化學(xué)染色，以成纖維細(xì)胞作為陰性對(duì)照，在顯微鏡下觀察，以胞膜和/或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為陽(yáng)性，每組選取不同的視野進(jìn)行計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。
　　 6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1MDSCs的消化、分

7、離、純化和細(xì)胞形態(tài)
　　 骨骼肌經(jīng)過(guò)混合酶消化后得到肌纖維碎片、骨骼肌細(xì)胞、血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等的混合物，用差速貼壁法將快速貼壁細(xì)胞與慢速貼壁細(xì)胞逐步分離，便可獲得MDSCs。PP1、PP2以成纖維細(xì)胞為主，細(xì)胞數(shù)量多，貼壁迅速，增殖快，5天左右完全融合;PP3、PP4以肌細(xì)胞為主，數(shù)量減少，增殖較快，1周左右完全融合;PP6貼壁的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，多為小圓形或梭形，體積較小，折光性好，增殖緩慢，另有少量懸浮的細(xì)胞。培

8、養(yǎng)72小時(shí)后細(xì)胞數(shù)量增多，呈現(xiàn)梭形或紡錘形，有小克隆團(tuán)形成，分散生長(zhǎng)在瓶底。1周左右細(xì)胞明顯分裂增殖，數(shù)量增多，密度增加，形成眾多細(xì)胞團(tuán)，呈簇狀生長(zhǎng)，細(xì)胞簇之間有明顯的界限，貼壁細(xì)胞展開(kāi)生長(zhǎng)呈梭形、紡錘性或多角形，細(xì)胞質(zhì)少，胞核增大。10天左右細(xì)胞繼續(xù)增殖，呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞之間相互融合，細(xì)胞簇體積增大并相連成片，細(xì)胞間隙變小。
　　 2MDSCs傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線
　　 生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)S形，經(jīng)過(guò)滯留期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期。培

9、養(yǎng)2天內(nèi)細(xì)胞分裂擴(kuò)增不明顯，生長(zhǎng)速度較慢;3天后細(xì)胞擴(kuò)增明顯，生長(zhǎng)速度加快，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;6天后細(xì)胞增殖受到抑制，生長(zhǎng)變慢，進(jìn)入平臺(tái)期。傳第一代細(xì)胞增殖速度快于傳四代和七代細(xì)胞，同時(shí)隨傳代次數(shù)增多，細(xì)
　　 3不同接種密度對(duì)MDSCs生長(zhǎng)的影響
　　 在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，吸光度數(shù)值與細(xì)胞數(shù)成正比。在1×106個(gè)/ml密度接種時(shí)吸光度值最大，細(xì)胞數(shù)量最多，活性較好，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和傳代培養(yǎng)。
　　 4MDSCs

10、的鑒定
　　 MDSCs對(duì)Desmin和Sca-1免疫細(xì)胞化學(xué)染色均呈陽(yáng)性表達(dá)，光鏡下胞膜胞漿呈現(xiàn)棕黃色，成纖維細(xì)胞呈陰性反應(yīng)。PP1～PP6中Desmin的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，PP6中兩者陽(yáng)性表達(dá)率均在90％以上。MDSCs傳一代、四代和七代的細(xì)胞中均對(duì)Desmin和Sca-1均呈陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率均在80％以上。
　　 結(jié)論:
　　 通過(guò)改良混合酶消化法和差速貼壁技術(shù)(preplate)，可以獲得新生SD大鼠的