寵物犬貓中乙腦的流行病學(xué)調(diào)查及利用衣殼蛋白靶向滅活技術(shù)抗乙腦病毒研究.pdf

1、豬流行性乙型腦炎(Japanese encepHalitis，JE)，簡稱乙腦，是由豬流行性乙型腦炎病毒(Japanese encepHalitis virus，JEV)引起的常見病毒性腦炎，其屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus）的成員。豬作為日本腦炎傳播的中間擴(kuò)增宿主，帶毒蚊子通過叮咬將感染性病毒傳播給人。豬乙型腦炎主要以蚊子為傳播媒介，在我國溫帶及亞熱帶地區(qū)有明顯的季節(jié)性，以每年的7～9月份發(fā)生較

2、多，而在12月至次年4月幾乎無病例發(fā)生，其對養(yǎng)豬業(yè)危害十分嚴(yán)重。目前對乙型腦炎的治療仍然沒有行之有效的方法，所以探索一種新的豬源的抗乙腦病毒策略已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。
　　 本文首先建立了日本乙型腦炎病毒ED3蛋白間接ELISA方法，經(jīng)測定，該方法的特異性、敏感性和符合率均比較高。然后把其用于檢測于06-10年間從四川、湖北、江蘇、上海、吉林、山東6省部分地區(qū)收集到的300份犬貓血樣的流行病學(xué)檢測，結(jié)果顯示長江流域四?。ㄋ拇?、湖北、

3、江蘇、上海）的JEV陽性率分別為17.46％、23.21％、64.10％和81.82％，北方兩?。ㄉ綎|和吉林）的JEV陽性率分別為6.67％和10.00％?？梢酝瓶闯鲩L江流域的JEV陽性率要明顯高于北方地區(qū)，并且從長江上游（四川）依次到長江下游入海口（上海），JEV陽性率逐漸升高，推測與蚊子的地理分布對乙腦的流行呈正向相關(guān)。隨著社會的經(jīng)濟(jì)發(fā)展，養(yǎng)犬、貓等寵物的人越來越多，這就使得犬貓成為乙腦傳播給人類的重要宿主之一，本實驗檢測犬貓血清3

4、5.67％的總陽性率就說明犬貓感染乙型腦炎比較普遍，給人類帶來了感染乙腦的壓力，因此我們不能忽視寵物犬貓這一重要的傳播宿主，我們有必要考慮是否應(yīng)該在寵物犬貓上普及乙型腦炎疫苗。
　　 衣殼蛋白靶向核酸酶滅活技術(shù)(CTVI)是一項新興的抗病毒策略，它和傳統(tǒng)的抗病毒策略相比有很多優(yōu)越性，為了要探索衣殼蛋白靶向核酸酶滅活技術(shù)(CTVI)是否可以作為一項對抗乙腦的抗病毒策略，根據(jù)豬乙型腦炎病毒衣殼蛋白(Cap)基因序列設(shè)計一對特異性引物

5、，RT-PCR擴(kuò)增獲得Cap基因后，將其插入到含有葡萄球菌核酸酶基因(SNase)的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-SNase中，該融合蛋白可以穩(wěn)定表達(dá)JEV的Cap蛋白和SNase。在G418壓力篩選下，BHK-21細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)該融合蛋白Cap-SNase(BHK-21/Cap-SNase)。而且該蛋白可以被兔抗乙腦多抗血清檢測到，并且在降解質(zhì)粒DNA方面具有良好的核酸酶活性。被JEV感染的BHK-21/Cap-SNase細(xì)胞系的病

6、毒滴度與普通BHK-21細(xì)胞相比降低了69.7％。它清楚地表明，融合蛋白Cap-SNase可以通過導(dǎo)致病毒滴度的降低來有效的抑制JEV復(fù)制。因此該方法可以是抑制日本腦炎病毒增殖的一種新型的抗病毒策略。
　　 豬流行性乙型腦炎衣殼蛋白是第一個被表達(dá)出來的蛋白，可以影響病毒的復(fù)制，目前關(guān)于乙腦病毒Cap蛋白功能的研究已取得一定進(jìn)展，但仍有許多問題需要解決，本實驗根據(jù)乙腦病毒Cap蛋白基因序列設(shè)計一上游引物，并把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PT

7、D)插入其中，根據(jù)葡萄球菌核酸酶(SNase)基因序列設(shè)計一下游引物。從重組質(zhì)粒pCDNA3.1-Cap-SN中PCR擴(kuò)增獲得PTD-Cap-SN基因，經(jīng)酶切和測序鑒定后，克隆到攜帶His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pColdI中，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pCold-PTD-Cap-SN。并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli BL21(ED3)中，利用IPTG于37℃振蕩培養(yǎng)24h，誘導(dǎo)表達(dá)了融合蛋白PTD-Cap-SN，對誘導(dǎo)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和West

8、ern blot分析。并利用其His標(biāo)簽在變性條件下通過Ni2+親合層析純化蛋白，經(jīng)SDS-PAGE將目的蛋白切膠后免疫Balb/c小鼠，制備了抗該融合蛋白的抗血清。結(jié)果表明SDS-PAGE顯示在相對分子質(zhì)量約30kDa處出現(xiàn)預(yù)期條帶，表達(dá)產(chǎn)物主要在包涵體表達(dá);Western blot檢測表明，表達(dá)產(chǎn)物能與His單抗以及豬乙腦病毒陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，出現(xiàn)單一反應(yīng)帶。表明豬乙腦衣殼蛋白及葡萄球菌核酸酶融合蛋白的原核表達(dá)成功且制備了其抗