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文檔簡介
1、豬流行性乙型腦炎(Japanese encepHalitis,JE),簡稱乙腦,是由豬流行性乙型腦炎病毒(Japanese encepHalitis virus,JEV)引起的常見病毒性腦炎,其屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)的成員。豬作為日本腦炎傳播的中間擴(kuò)增宿主,帶毒蚊子通過叮咬將感染性病毒傳播給人。豬乙型腦炎主要以蚊子為傳播媒介,在我國溫帶及亞熱帶地區(qū)有明顯的季節(jié)性,以每年的7~9月份發(fā)生較
2、多,而在12月至次年4月幾乎無病例發(fā)生,其對養(yǎng)豬業(yè)危害十分嚴(yán)重。目前對乙型腦炎的治療仍然沒有行之有效的方法,所以探索一種新的豬源的抗乙腦病毒策略已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。
本文首先建立了日本乙型腦炎病毒ED3蛋白間接ELISA方法,經(jīng)測定,該方法的特異性、敏感性和符合率均比較高。然后把其用于檢測于06-10年間從四川、湖北、江蘇、上海、吉林、山東6省部分地區(qū)收集到的300份犬貓血樣的流行病學(xué)檢測,結(jié)果顯示長江流域四?。ㄋ拇?、湖北、
3、江蘇、上海)的JEV陽性率分別為17.46%、23.21%、64.10%和81.82%,北方兩?。ㄉ綎|和吉林)的JEV陽性率分別為6.67%和10.00%??梢酝瓶闯鲩L江流域的JEV陽性率要明顯高于北方地區(qū),并且從長江上游(四川)依次到長江下游入海口(上海),JEV陽性率逐漸升高,推測與蚊子的地理分布對乙腦的流行呈正向相關(guān)。隨著社會的經(jīng)濟(jì)發(fā)展,養(yǎng)犬、貓等寵物的人越來越多,這就使得犬貓成為乙腦傳播給人類的重要宿主之一,本實驗檢測犬貓血清3
4、5.67%的總陽性率就說明犬貓感染乙型腦炎比較普遍,給人類帶來了感染乙腦的壓力,因此我們不能忽視寵物犬貓這一重要的傳播宿主,我們有必要考慮是否應(yīng)該在寵物犬貓上普及乙型腦炎疫苗。
衣殼蛋白靶向核酸酶滅活技術(shù)(CTVI)是一項新興的抗病毒策略,它和傳統(tǒng)的抗病毒策略相比有很多優(yōu)越性,為了要探索衣殼蛋白靶向核酸酶滅活技術(shù)(CTVI)是否可以作為一項對抗乙腦的抗病毒策略,根據(jù)豬乙型腦炎病毒衣殼蛋白(Cap)基因序列設(shè)計一對特異性引物
5、,RT-PCR擴(kuò)增獲得Cap基因后,將其插入到含有葡萄球菌核酸酶基因(SNase)的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-SNase中,該融合蛋白可以穩(wěn)定表達(dá)JEV的Cap蛋白和SNase。在G418壓力篩選下,BHK-21細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)該融合蛋白Cap-SNase(BHK-21/Cap-SNase)。而且該蛋白可以被兔抗乙腦多抗血清檢測到,并且在降解質(zhì)粒DNA方面具有良好的核酸酶活性。被JEV感染的BHK-21/Cap-SNase細(xì)胞系的病
6、毒滴度與普通BHK-21細(xì)胞相比降低了69.7%。它清楚地表明,融合蛋白Cap-SNase可以通過導(dǎo)致病毒滴度的降低來有效的抑制JEV復(fù)制。因此該方法可以是抑制日本腦炎病毒增殖的一種新型的抗病毒策略。
豬流行性乙型腦炎衣殼蛋白是第一個被表達(dá)出來的蛋白,可以影響病毒的復(fù)制,目前關(guān)于乙腦病毒Cap蛋白功能的研究已取得一定進(jìn)展,但仍有許多問題需要解決,本實驗根據(jù)乙腦病毒Cap蛋白基因序列設(shè)計一上游引物,并把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PT
7、D)插入其中,根據(jù)葡萄球菌核酸酶(SNase)基因序列設(shè)計一下游引物。從重組質(zhì)粒pCDNA3.1-Cap-SN中PCR擴(kuò)增獲得PTD-Cap-SN基因,經(jīng)酶切和測序鑒定后,克隆到攜帶His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pColdI中,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pCold-PTD-Cap-SN。并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli BL21(ED3)中,利用IPTG于37℃振蕩培養(yǎng)24h,誘導(dǎo)表達(dá)了融合蛋白PTD-Cap-SN,對誘導(dǎo)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和West
8、ern blot分析。并利用其His標(biāo)簽在變性條件下通過Ni2+親合層析純化蛋白,經(jīng)SDS-PAGE將目的蛋白切膠后免疫Balb/c小鼠,制備了抗該融合蛋白的抗血清。結(jié)果表明SDS-PAGE顯示在相對分子質(zhì)量約30kDa處出現(xiàn)預(yù)期條帶,表達(dá)產(chǎn)物主要在包涵體表達(dá);Western blot檢測表明,表達(dá)產(chǎn)物能與His單抗以及豬乙腦病毒陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng),出現(xiàn)單一反應(yīng)帶。表明豬乙腦衣殼蛋白及葡萄球菌核酸酶融合蛋白的原核表達(dá)成功且制備了其抗
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