Xenorhabdus budapestensis D43菌株殺蟲蛋白的分離純化及致病機(jī)理的研究.pdf

1、昆蟲病原線蟲共生菌是一種重要的微生物資源，它能夠產(chǎn)生多種具有殺蟲、抑菌、抗腫瘤等功能的代謝產(chǎn)物，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域顯示出巨大的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。特別是昆蟲病原線蟲共生菌能夠產(chǎn)生多種殺蟲蛋白，不僅可以直接作為蛋白質(zhì)農(nóng)藥，而且能夠?yàn)檗D(zhuǎn)基因抗蟲植物和殺蟲工程菌株的發(fā)展提供更多新穎的基因資源。本研究以從中國(guó)東北土壤樣品獲得的擬雙角斯氏線蟲中分離的共生菌Xenorhabdusbudapestensis D43為試驗(yàn)材料，對(duì)該菌株細(xì)胞內(nèi)的蛋白進(jìn)

2、行了純化和篩選，并對(duì)篩選到具有殺蟲活性的蛋白進(jìn)行了鑒定、基因克隆、序列生物信息學(xué)分析、重組蛋白的表達(dá)和純化，以及致病機(jī)理等方面的研究，得出主要研究結(jié)果如下：
　　 1、昆蟲病原線蟲共生菌X.budapestensis D43菌株細(xì)胞內(nèi)含有大量的蛋白種類，本研究利用制備型凝膠電泳的方法成功純化到4種，其中一種對(duì)大蠟螟幼蟲具有血腔注射活性，命名為HIP57。生物測(cè)定結(jié)果顯示，該蛋白對(duì)5齡大蠟螟幼蟲的LD50為206.81ng/頭；當(dāng)

3、以不低于490ng/頭的劑量注射時(shí)，試蟲體色會(huì)在15min之內(nèi)變黑，48h死亡率為100％。
　　 2、經(jīng)過(guò)雙向電泳分析和質(zhì)譜鑒定，HIP57的分子量約為60kDa，等電點(diǎn)4～5，與GroEL蛋白具有較高同源性。GroEL雖為分子伴侶，但在本研究中，來(lái)自于共生菌X。budapestensis D43菌株的HIP57顯示出殺蟲功能?？寺～@得HIP57基因全長(zhǎng)1647bp(GenBank accession no.JN863588)

4、，編碼548個(gè)氨基酸殘基(GenBank accession no。AEU10771)。
　　 3、生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，HIP57蛋白的相對(duì)分子量為57379.7Da，理論等電點(diǎn)為4.77，與電泳結(jié)果相吻合；該蛋白序列中不含信號(hào)肽，屬于穩(wěn)定的水溶性蛋白；同時(shí)采用4種不同的預(yù)測(cè)原理分析了HIP57的二級(jí)結(jié)構(gòu)，特別是運(yùn)用同源模建構(gòu)建了精確度較高的HIP57蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)；通過(guò)HIP57蛋白與其他4種同樣來(lái)源于昆蟲病原線蟲共生菌的G

5、roEL蛋白進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該蛋白擁有一些特有的氨基酸殘基；根據(jù)GroEL蛋白氨基酸序列的同源性，本研究成功構(gòu)建了43種腸桿菌科細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，將X.budapestensis D43聚類至致病桿菌屬，顯示出GroEL蛋白序列具有在細(xì)菌分類學(xué)和進(jìn)化學(xué)應(yīng)用的潛在性。
　　 4、對(duì)HIP57、GFP和HIP57-GFP進(jìn)行了原核表達(dá)，同時(shí)獲得了純度較高的3種重組蛋白。經(jīng)western blotting分析，這些重組蛋白與其相應(yīng)的

6、抗體都能夠發(fā)生特異性結(jié)合。與天然HIP57蛋白引起試蟲通體黑化現(xiàn)象和高致死活性相比，HIP57和GFP重組蛋白沒(méi)有顯示出這樣的功能；而HIP57-GFP重組蛋白雖不對(duì)試蟲具有致死活性，但是能夠引起試蟲體內(nèi)出現(xiàn)大量的黑色結(jié)節(jié)。
　　 5、HIP57蛋白對(duì)大蠟螟幼蟲致病機(jī)理的研究結(jié)果包括：其一，HIP57能夠引起大蠟螟幼蟲強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，包括PO活力顯著升高，血細(xì)胞數(shù)量顯著降低，以及血細(xì)胞包囊反應(yīng)；其二，大蠟螟注射HIP57后，有2

7、3種血淋巴蛋白的表達(dá)量發(fā)生顯著變化，其中4種獲得成功鑒定，分別為ApoLp-Ⅲ、Serpin、P27K和GST；其三，捕獲2種與HIP57具有潛在結(jié)合作用的血淋巴蛋白，分別為芳基貯存蛋白和β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白前體。
　　 雖然在昆蟲病原線蟲共生菌復(fù)合體侵染寄主昆蟲過(guò)程中，HIP57是否被分泌的問(wèn)題本研究未能給出答案，但HIP57顯示出非常高的致病性，如果在昆蟲病原線蟲共生菌復(fù)合體致病過(guò)程中能夠被分泌到寄主血腔中，應(yīng)為一種重