大蠟螟病原菌菌株BP-1的鑒定及其殺蟲蛋白的分離純化與毒力測定.pdf

1、大蠟螟（Galleria mellonella）分布廣泛，屬于鱗翅目、螟蛾科、蠟螟亞科、蠟螟屬昆蟲。大蠟螟對中蜂危害嚴(yán)重，主要以幼蟲，尤以3-5齡幼蟲取食巢脾，使蜂不能封蓋，造成蜂群內(nèi)蜂蛹形成“白頭蛹”，不能羽化，即使勉強羽化，幼蜂也會被大蠟螟分泌的絲線困在巢房內(nèi)，給世界養(yǎng)蜂產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的危害。多年來，國內(nèi)外研究人員從許多方面研究了大蠟螟的有效防治方法。
　　 在自然界中由于大蠟螟主要取食蜜蜂的巢脾，所以在防治方法上要特別注意

2、其對蜜蜂的傷害，因此生物防治是比較理想的選擇，目前在生物防治領(lǐng)域中，開發(fā)利用最廣泛的生防菌劑集中在芽孢桿菌和真菌上，如蘇云金芽孢桿菌和綠僵菌等，特別是蘇云金芽孢桿菌的廣泛使用，它在芽孢形成期間產(chǎn)生的殺蟲蛋白晶體對大蠟螟具有毒力。不過長期依賴單一殺蟲菌會使大蠟螟產(chǎn)生相當(dāng)?shù)目剐?，?dǎo)致當(dāng)前大量使用的生物殺蟲劑的效果下降。因此，有必要擴大病原菌的范圍，開發(fā)新的防治大蠟螟的病原菌。
　　 本研究從一頭自然病死的大蠟螟尸體中分離到一株病原菌

3、BP-1，通過回復(fù)感染大蠟螟老熟幼蟲，其致病性符合KOCH定則，該菌的最適生長pH范圍是7-8，最適鹽濃度是1％，其在培養(yǎng)2 h后進入對數(shù)生長期，并持續(xù)到7 h，8 h-24 h是穩(wěn)定期。該菌革蘭氏陽性，V.P反應(yīng)陽性；硝酸鹽還原陽性；可以水解淀粉；可以使明膠液化；不產(chǎn)生硫化氫；可以利用丙酸鹽，檸檬酸鹽。能利用葡萄糖，蔗糖，乳糖。結(jié)合16SrDNA分子鑒定，確定該菌為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）

4、。
　　 對其發(fā)酵上清液的殺蟲活性進行了初步測定，顯示注射20μL濃度為1.0μgμL-1的病原菌BP-1發(fā)酵上清液于大蠟螟老熟幼蟲，24 h后的校正死亡率為91.23％±3.04％，每1 g人工飼料加100μL病原菌株BP-1發(fā)酵上清飼喂大蠟螟初孵幼蟲，168h后，校正死亡率為43.25％±4.365％。體重抑制率為59.16％±2.250％，顯示病原菌株BP-1具有較強的血腔毒力和胃毒活力。病原菌BP-1的最佳發(fā)酵時間為16

5、h。用蛋白酶K處理的發(fā)酵上清液進行殺蟲活性實驗，校正死亡率為8.77％±3.04％，說明具有殺蟲活性的物質(zhì)是存在于細菌上清液中的殺蟲蛋白。
　　 殺蟲蛋白經(jīng)硫酸銨飽和沉淀得到殺蟲蛋白粗提物，經(jīng)Sephadex G-75凝膠層析出現(xiàn)兩個峰，胃毒活力和血腔毒力測定顯示峰1為活性峰.將活性峰收集過DEAE-Seharose FF，僅出現(xiàn)一個峰，此時得到的峰中的蛋白已較純，每1 g人工飼料加100μg該峰凍干粉飼喂大蠟螟初孵幼蟲，初步檢

6、測其對大蠟螟的胃毒活力，168 h后，該峰校正死亡率為63.86％±4.25％，體重抑制率為68.64％±0.4473％，將該峰凍干粉溶解，濃度為1.6μg.μL-1，注射10μL于大蠟螟老熟幼蟲，初步檢測其對大蠟螟的血腔毒力，24 h后，該峰的校正死亡率為93.58％±5.268％。
　　 SDS-PAGE電泳表明殺蟲蛋白為單鏈蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量約為37 kD，命名為BA1P37。
　　 進一步測定殺蟲蛋白BA1P37對

7、大蠟螟幼蟲致死中濃度（LC50），24 h后，結(jié)果顯示：殺蟲蛋白BA1P37對大蠟螟老熟幼蟲具有顯著的血腔毒性。LC50為0.457μg.μL-1，即以濃度為0.457μg.μL-1的殺蟲蛋白BA1P37來注射大蠟螟老熟幼蟲，每頭注射10μL，可以殺死50％的大蠟螟老熟幼蟲，且隨著殺蟲蛋白濃度的增加，大蠟螟的死亡率逐漸升高，168 h的胃毒測定結(jié)果顯示，LC50為56.973μg.g-1，即以56.973μg殺蟲蛋白BA1P37加入1g