伯氏致病桿菌Xenorhabdus bovieniiBE的培養(yǎng)條件及殺蟲(chóng)活性物質(zhì)的初步探索.pdf

1、線蟲(chóng)一共生菌復(fù)合體具有安全性高、殺蟲(chóng)能力強(qiáng)、殺蟲(chóng)譜廣的優(yōu)點(diǎn)，線蟲(chóng)又具有主動(dòng)搜索能力，所以具有開(kāi)發(fā)成為新型生物殺蟲(chóng)劑的潛力.本實(shí)驗(yàn)采用斯氏線蟲(chóng)Steinernera feltia比利時(shí)品種為材料，培養(yǎng)該線蟲(chóng)的共生菌Xenorhabdus bovienii BE，將共生菌的生長(zhǎng)情況和最佳發(fā)酵條件進(jìn)行測(cè)定，從而為進(jìn)一步對(duì)該共生菌的研究及發(fā)酵液大規(guī)模生產(chǎn)提供必要的前提條件；實(shí)驗(yàn)對(duì)共生菌發(fā)酵液及其成分的殺蟲(chóng)活性進(jìn)行生物測(cè)定，尋找該菌的殺蟲(chóng)活性物質(zhì)

2、，并對(duì)活性物質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行初步研究，從而為害蟲(chóng)的生物防治提供新的微生物殺蟲(chóng)資源。 本研究對(duì)Steinernerafeltia共生菌Xenorhabdus bovienii BE的培養(yǎng)特性和最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行測(cè)定；逐步對(duì)該共生菌發(fā)酵液及其成分的殺蟲(chóng)活性進(jìn)行生物測(cè)定，尋找該菌的殺蟲(chóng)活性物質(zhì)；對(duì)殺蟲(chóng)活性物質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行研究并對(duì)其血腔，口服LD50進(jìn)行測(cè)定。 1斯氏線蟲(chóng)Steinernerafeltia共生菌Xenorhabdus b

3、ovienii BE的生長(zhǎng)情況：0-6h為延遲期，6-12h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12-22h為穩(wěn)定期，22h后細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期，在液體NA培養(yǎng)基上，此伯氏致病桿菌的最適培養(yǎng)溫度為27.5℃，最佳搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，最適pH值范圍為7.0～7.5；初始接種量對(duì)菌株的生長(zhǎng)有明顯的影響，最理想的接菌量為6％；250ml三角瓶的最佳裝液量為35ml，即最佳裝液量為所盛培養(yǎng)基容積的14％。 2共生菌殺蟲(chóng)活性物質(zhì)的探測(cè)及生物測(cè)定：測(cè)定結(jié)

4、果顯示斯氏線蟲(chóng).Steinernera feltiae比利時(shí)品系的共生菌伯氏致病桿菌Xenorhabdus bovienii BE發(fā)酵液對(duì)供試?yán)ハx(chóng)大蠟螟老齡幼蟲(chóng)有很高的血腔毒性，通過(guò)對(duì)發(fā)酵液硫酸銨鹽析和乙酸乙酯抽提物等進(jìn)行生物測(cè)定，發(fā)現(xiàn)共生菌的殺蟲(chóng)物質(zhì)主要為胞外和胞內(nèi)蛋白成分，且胞內(nèi)粗提蛋白活性明顯高于胞外粗提蛋白.以Marker分子量范圍為14.3-97.2kDa為參照，對(duì)兩種粗提蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)胞外粗提蛋白在此分子

5、量范圍內(nèi)沒(méi)有明顯的條帶，而胞內(nèi)粗提蛋白則有較明顯的五個(gè)條帶；胞內(nèi)粗提蛋白在24h和48h后對(duì)昆蟲(chóng)的血腔毒性的LD50值分別為4.7316g/L和1.5715g/L；其在5天后對(duì)二齡幼蟲(chóng)的口服LD50為253.7579μg/g.胞內(nèi)粗提蛋白凝膠過(guò)濾后呈現(xiàn)為4個(gè)峰值，分別對(duì)其進(jìn)行SDS-PAGE分析，只有濃度較大的峰值1和4產(chǎn)生明顯條帶，分子量分別為約66.4kDa和20.1-29.OkDa之間的兩種復(fù)合蛋白；分別對(duì)它們進(jìn)行血腔和口服毒性的

6、生測(cè)，發(fā)現(xiàn)分子量在20.1-29.OkDa之間的兩種復(fù)合蛋白活性高于分子量約為66.4kDa的殺蟲(chóng)活性，其在24h和48h后對(duì)昆蟲(chóng)的血腔毒性的LD50分別為0.3772g/L和0.1238g/L，其在5天后對(duì)二齡幼蟲(chóng)的口服LD50為93.0021μg/g。 3殺蟲(chóng)粗提蛋白的性質(zhì)： 研究表明胞內(nèi)粗提蛋白具有較高的熱穩(wěn)定性，測(cè)定的鹽析最佳硫酸銨飽和度為80％，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法所得到的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線及從中得出的標(biāo)準(zhǔn)方程，從中求得