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文檔簡介
1、牛肉大理石紋(BeefMarbling)是沉積于肌束和肌纖維之間的一定量肌內脂肪所呈現的外觀表現,即包括肌內脂肪(Intramuscularfat,IMF)含量和分布,是衡量牛肉質量等級的最關鍵指標。作為大理石紋的物質基礎,IMF直接參與肉質嫩度、風味和多汁性等性能的形成,是影響肉質性狀與經濟價值的最為重要因素。由于傳統(tǒng)肉質選育方法無法進行活體直接測定,選育成本高,進度遲緩,利用DNA標記篩選IMF性能的主效基因成為改進IMF含量和脂肪
2、酸組成、提高肉質性能的有效方法。本實驗以日本黑毛和牛為研究對象,采用添加含肥育牛血漿的成脂誘導培養(yǎng)基,檢測肌內前體脂肪細胞分化過程中相關基因表達,并結合屠宰實驗分析這些基因表達水平與大理石紋等級(BeefMarblingStandard,BMS)、肌肉不飽和度(Unsaturatedfattyacids/Saturatedfattyacids,US/S)的相關性,篩選影響日本黑毛和牛肌內脂肪沉積的候選基因,為進一步探究肌內脂肪沉積的機制
3、,改善肉品品質提供理論依據。主要研究內容如下:
1.牛肌內前體脂肪(Bovineintramuscularpreadipocyte,BIP)細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
采集3頭成年育肥日本黑毛黑牛第6-7肋間的肌肉,分離肌內脂肪組織,利用膠原酶消化法分離獲得牛肌內前脂肪細胞,體外培養(yǎng),繪制生長曲線,誘導BIP細胞成脂分化,采用油紅O染色法和RT-PCR鑒定誘導所得細胞。結果顯示,分離培養(yǎng)的BIP細胞均一性良好,呈
4、梭形,貼壁生長,生長曲線呈“S”形,倍增時間43.3h;經成脂誘導培養(yǎng)8d,油紅0染色可見胞內紅色脂滴,RT-PCR檢測顯示,BIP細胞表達GLUT-1,不表達GLUT-4,而誘導所得BIP細胞表達GLUT-1,GLUT-4的表達豐度較低。本實驗證明分離培養(yǎng)所得細胞具有BIP細胞形態(tài)和基因表達特性,為后續(xù)實驗奠定基礎。
2.BIP細胞化過程中成脂基因的表達分析
復蘇所得的凍存BIP細胞,傳代2-3次,利用含5
5、mM辛酸、50ng/mL胰島素、0.25mM地塞米松和10mM乙酸鈉的成脂誘導培養(yǎng)基定向誘導BIP細胞向成熟脂肪細胞分化,收集誘導0、2、4、6、8d細胞,提取細胞總RNA,采用實時熒光定量PCR方法檢測細胞分化過程中成脂基因的表達。結果顯示,轉錄因子PPAR-γ和C/EBP-δ在誘導2d明顯大幅上調,其中,PPAR-γ于2d達到表達高峰,4d明顯回落,隨后維持穩(wěn)定略有升高趨勢;C/EBP-δ表達于4d達到最高水平,6d顯著下調,之后穩(wěn)
6、定略有升高。然而,SREBP-1表達水平呈一種基本穩(wěn)定略有下降趨勢,正常培養(yǎng)和成脂誘導培養(yǎng)的細胞內SREBP-1表達無顯著差異。脂肪合成相關酶基因FASN和SCD表達水平隨誘導培養(yǎng)呈”上升-下降-上升”趨勢,于8d出現最高表達。脂肪酸轉運相關基因aP2和CD36表達水平在分化前中期相似,即在誘導2d迅速表達,達到表達峰值,4d明顯下調;在分化中后期,aP2表達逐漸升高,8d達到最高水平,而CD36維持穩(wěn)定略有升高趨勢。脂肪酸轉運基因之一
7、的FATP1處于相對穩(wěn)定略有下調狀態(tài)。本實驗結果表明,在分化早期以轉錄因子的轉錄激活為主,而中后期脂肪酸合成和跨膜轉運更活躍。此外,上述基因的表達模式可能存在種屬差異和細胞系差異。
3.BIP細胞分化過程中成脂基因的表達水平與IMF性能的相關性分析
選取源于日本東北部4個區(qū)域的47頭日本黑毛和牛,分別飼喂正常飼料和添加膨軟米的飼料,于肥育期(22月齡)采集血液樣本,制備血漿,用于配制47個誘導培養(yǎng)基。復蘇所得
8、的凍存BIP細胞,傳代2-3次,利用含2.5%肥育牛血漿和7.5%胎牛血清(Fetalbovineserum,FBS)的成脂誘導培養(yǎng)基,分別定向誘導BIP細胞向成熟脂肪細胞分化,收集誘導8d細胞,提取細胞總RNA,采用實時熒光定量PCR方法檢測細胞分化過程中成脂基因的表達。屠宰達到上市期(27-31月齡)的47頭實驗用牛,采集最長肌,按照日本牛肉質量分級標準評定BMS,同時檢測肌內脂肪酸組成,分析與誘導后BIP細胞內成脂基因的相關性。結
9、果表明:屠宰時BMS分別與aP2(R=0.469)、SREBP-1(R=0.389)和PPAR-γ(R=0.533)的表達水平之間存在正相關,差異極顯著(P<0.01)。屠宰時最長肌的US/S與SREBP-1表達量(R=0.398)呈現正相關,差異極顯著(P<0.01)?;诜视Q獫{來源進一步分析,使用飼喂正常飼料的牛血漿,BMS與PPAR-γ表達(R=0.428)呈明顯正相關(P<0.05),最長肌的US/S與SREBP-1表達(R
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