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1、銅綠假單胞菌根際株(Pseudomonas aeruginosa rizhosphere strain) M18是所在研究室從甜瓜植物根際分離的一株生防菌株,其主要抗菌代謝產(chǎn)物吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid,PCA)是一種黃色晶體,具有高效、廣譜的抗菌活性的含氮雜環(huán)化合物。以PCA為主要成分的微生物源殺菌劑,已經(jīng)由我國農(nóng)藥命名單位定名為申嗪霉素。申嗪霉素原藥和1%申嗪霉素懸浮劑于2011年獲得了農(nóng)
2、業(yè)部頒發(fā)的正式登記證,農(nóng)業(yè)部已經(jīng)將申嗪霉素列入“十二五”期間全國推廣產(chǎn)品。但是,PCA對病源菌的防病效果受使用時的酸度(pH)值的嚴(yán)重影響,在pH值7.0的條件下,其抗菌活性僅為pH值5.0條件下的20%,在堿性條件下PCA的防病效果大大降低。
吩嗪-1-酰胺(phenazine-1-carboxamide,PCN)作為一種PCA的酰胺化衍生物,具有同樣廣譜的抗真菌活性,同時與PCA相比,PCN的抗真菌的活性不受使用環(huán)境的
3、pH值的影響,在中性和堿性pH環(huán)境中,PCN抗真菌的活性是PCA的5到10倍。PCN是由PCA衍生而來的,其轉(zhuǎn)化過程需要谷酰胺吩嗪-1-羧酸酰胺轉(zhuǎn)移酶(glutamine phenazine-1-carboxylic acid amidotransferase,PhzH)的催化作用,而基因組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)促生拮抗菌株M18的基因組中,基因phzH是一個已經(jīng)發(fā)生點突變的基因。
我們首先分析了菌株M18的代謝產(chǎn)物,結(jié)果表明M18
4、的基因組中發(fā)生點突變的PhzH沒有活性;其次,從銅綠假單胞菌PAO1中克隆出有活性的PhzH編碼基因,恢復(fù)M18基因組中的phzH,獲得phzH恢復(fù)株M18H+,HPLC分析結(jié)果顯示在M18H+的發(fā)酵液中產(chǎn)生一種新的不同于PCA的化合物;通過氯仿萃取和硅膠柱層析分離,獲得了這種新的化合物,經(jīng)過質(zhì)譜分析進(jìn)一步證實M18H+中新產(chǎn)生的化合物為PCN;對PCN的溶解度分析表明,它在水、甲醇、乙醇中的溶解度隨著溫度的升高而增加,在水中的溶解度最
5、低,在甲醇中的溶解度最高,同時與PCA相比,PCN在相同的溶劑中的溶解度都要低于PCA的溶解度,雖然兩個化合物只有一個基團(tuán)的差異;初步的抑菌活性分析表明,PCN對水稻紋枯病的抑菌活性在pH4-8之間保持比較穩(wěn)定,而PCA在pH7時,抑菌活性急劇降低,只有其在pH5時的活性的20%,在更高的pH環(huán)境中,抑菌活性則完全消失,這與已有的報道是相吻合的。為了進(jìn)一步提高PCN的發(fā)酵效價,我們進(jìn)一步構(gòu)建了PCN的高產(chǎn)菌株,構(gòu)建了PhzH過表達(dá)的質(zhì)粒
6、pBBRphzH,將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化恢復(fù)了phzH的實驗室已有的高產(chǎn)PCA的工程菌株M18G,獲得高產(chǎn)PCN的生物工程菌株M18G/pBBRphzH,在該菌株中,發(fā)酵48小時后,發(fā)酵液中PCA基本全部轉(zhuǎn)化為PCN,轉(zhuǎn)化效率為100%,經(jīng)初步發(fā)酵,該工程菌株中PCN的效價已經(jīng)達(dá)4gL-1。
綜上,本文運用分子生物學(xué)技術(shù)在假單胞菌M18中實現(xiàn)了PCA的高效酰胺化為PCN的目標(biāo),并對PCN的化學(xué)特性和抗菌活性進(jìn)行了初步分析,初步構(gòu)建了
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