假單胞菌M18 gacS和gacA基因的克隆、蛋白表達與純化研究.pdf

1、上海交通大學碩士學位論文假單胞菌假單胞菌M18gacS和gacA基因的克隆、蛋白表達與純化研究基因的克隆、蛋白表達與純化研究學校：學校：上海交通大學院系：院系：生命科學技術學院碩士生：碩士生：任慧娟專業(yè)：專業(yè)：生物化學與分子生物學導師：導師：李榮秀教授、董德賢副研究員上海交通大學生命科學技術學院上海交通大學生命科學技術學院2010年1月月上海交通大學碩士研究生學位論文假單胞菌假單胞菌M18gacS和gacA基因的克隆、基因的克隆、蛋白表

2、達與純化研究蛋白表達與純化研究摘要摘要感受激酶GacS(globalactivatsenskinase)和反應調(diào)控因子GacA(globalantibioticcyanidecontrol)是雙元調(diào)控系統(tǒng)（twocomponentregulatysystem）的兩個組分。GacSGacA系統(tǒng)調(diào)控胞外生防因子和致病因子的合成，是抗生素等次級代謝產(chǎn)物合成所必需的。在許多革蘭氏陰性菌中，保守的雙組分調(diào)控系統(tǒng)GacSGacA對細菌胞外產(chǎn)物的合成

3、與分泌具有決定性的控制作用。如在一些植物、動物和人的病原菌中，當gacS或者gacA基因發(fā)生突變時，突變株的多種胞外產(chǎn)物分泌受到不同程度的抑制，對植物、動物和人的致病性也顯著降低。目前對GacS、GacA蛋白的研究主要是對gacS、gacA基因突變，分析突變對細胞胞外產(chǎn)物等各個方面的影響。尚無對GacS、GacA蛋白的直接獲得及研究。因此，gacS、gacA的克隆、表達與純化及深入的研究是一個極富意義的研究領域。本課題對雙元調(diào)控系統(tǒng)的g

4、acS和gacA進行克隆、蛋白表達與純化研究。以假單胞菌M18全基因組為模板，pET28b（）為載體，克隆gacS、gacA基因。將重組質(zhì)粒pETgacA經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中IPTG誘導表達，GacA蛋白得到可溶性表達。表達產(chǎn)物經(jīng)金屬螯合層析柱純化，蛋白純度約為95%，MALDITOF鑒定證明純化的蛋白為假單胞菌M18GacA蛋白。對GacA進行熱穩(wěn)定性分析，GacA蛋白不耐高溫，40℃10min即變性沉淀。GacA