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文檔簡(jiǎn)介
1、棉花不僅是最重要的纖維作物,還是僅次于大豆的第二大油料作物和蛋白來(lái)源,是重要的世界性經(jīng)濟(jì)作物,其栽培、生產(chǎn)和加工對(duì)世界政治和經(jīng)濟(jì)起著深遠(yuǎn)的影響。近年來(lái),棉花的常規(guī)育種在提高棉花產(chǎn)量以及改善棉花纖維品質(zhì)等方面取得了一定的進(jìn)展。然而,由于受技術(shù)和種質(zhì)資源的限制,在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)的大幅度同步提高,相對(duì)困難。棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)不受親緣關(guān)系制約,可以有目的、有計(jì)劃的將靶標(biāo)基因?qū)胫参锘蚪M中,而且能夠在新背景條件下穩(wěn)定遺傳和表達(dá),從
2、而實(shí)現(xiàn)優(yōu)良基因共享、打破基因連鎖、定向改造植物遺傳特性以及縮短育種時(shí)間等目標(biāo),為棉花的科學(xué)技術(shù)研究帶來(lái)了新的曙光。棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)以植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生為基礎(chǔ),進(jìn)行棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)理的細(xì)胞學(xué)以及分子生物學(xué)相關(guān)研究就顯得尤為重要。
MADS-box基因家族編碼一類特異性轉(zhuǎn)錄因子,它們?cè)谥参锇l(fā)育的諸多過(guò)程中均發(fā)揮著非常重要的作用。該家族基因編碼的蛋白質(zhì)N末端均具備一個(gè)高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,約60個(gè)氨基酸大小。AGL15是
3、MADS-box基因家族中的一個(gè)亞家族成員,研究表明該家族基因在植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,不過(guò),在棉花中的研究尚未見報(bào)道。本研究利用同源克隆技術(shù)從陸地棉中克隆獲得4個(gè)AGL15家族基因,主要研究結(jié)果如下:
1.陸地棉GhAGL15基因的克隆及生物信息學(xué)分析
利用擬南芥AtAGL15氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì),以陸地棉CCRI cDNA為模板,進(jìn)而通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得目的基因。對(duì)得到的四個(gè)目的基因序列分
4、別進(jìn)行生物信息學(xué)分析,主要包括序列分析、多重序列比對(duì)以及進(jìn)化樹構(gòu)建等。結(jié)果表明它們均屬于A GL15亞家族成員,并分別命名為GhAGL15-1、GhAGL15-2、GhAGL15-3和GhAGL15-4。
2.陸地棉GhAGL15轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位分析
將目的基因GhAGL15-1、GhAGL15-2、GhAGL15-3和GhAGL15-4分別構(gòu)建35S-GhAGL15-GFP瞬時(shí)表達(dá)載體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法
5、將融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細(xì)胞,進(jìn)行顯微觀察。綠色熒光蛋白信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的分布情況表明它們均定位子細(xì)胞核。
3.陸地棉GhAGL15基因的表達(dá)模式分析
熒光定量結(jié)果表明,在非胚性器官(根、莖、幼葉和花瓣)中,GhAGL15-1、GhAGL15-2、GhAGL15-3和GhAGL15-4基因在莖和葉中的表達(dá)量極低;然而在花瓣中均具有較高的表達(dá)量。GhAGL15-2是唯一在根中具有較高表達(dá)量的基因,GhAGL15
6、-1、GhAGL15-3和GhAGL15-4在根中的表達(dá)量均非常低。在體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中,GhAGL15-1基因在胚性愈傷組織中的表達(dá)量最高;GhAGL15-2基因在愈傷組織中的表達(dá)量相對(duì)較低,表達(dá)量在胚性愈傷組織發(fā)育階段持續(xù)增加,在胚性愈傷組織發(fā)育的后期達(dá)到峰值。GhAGL15-3和GhAGL15-4基因的表達(dá)水平穩(wěn)定增加,在胚性愈傷組織發(fā)育后期達(dá)到最高后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。GhAGL15-1、GhAGL15-2、GhAGL15-3和Gh
7、A GL15-4在胚狀體四個(gè)時(shí)期(球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉形胚)的表達(dá)量均表現(xiàn)出最低,有的甚至很難檢測(cè)出表達(dá)量的存在。
4.陸地棉GhAGL15-3基因啟動(dòng)子的克隆及生物信息學(xué)分析
采用同源克隆方法,克隆得到GhAGL15-3基因啟動(dòng)子序列,其長(zhǎng)為1232bp。分析可能存在的基礎(chǔ)啟動(dòng)子區(qū)域有兩處。預(yù)測(cè)TSS在第1047bp處的T。含有分生組織表達(dá)響應(yīng)元件、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件以及干旱脅迫響應(yīng)元
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