陸地棉AGL15同源基因cDNAs的克隆及功能驗(yàn)證.pdf

1、棉花不僅是最重要的纖維作物，還是僅次于大豆的第二大油料作物和蛋白來(lái)源，是重要的世界性經(jīng)濟(jì)作物，其栽培、生產(chǎn)和加工對(duì)世界政治和經(jīng)濟(jì)起著深遠(yuǎn)的影響。近年來(lái)，棉花的常規(guī)育種在提高棉花產(chǎn)量以及改善棉花纖維品質(zhì)等方面取得了一定的進(jìn)展。然而，由于受技術(shù)和種質(zhì)資源的限制，在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)的大幅度同步提高，相對(duì)困難。棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)不受親緣關(guān)系制約，可以有目的、有計(jì)劃的將靶標(biāo)基因?qū)胫参锘蚪M中，而且能夠在新背景條件下穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，從

2、而實(shí)現(xiàn)優(yōu)良基因共享、打破基因連鎖、定向改造植物遺傳特性以及縮短育種時(shí)間等目標(biāo)，為棉花的科學(xué)技術(shù)研究帶來(lái)了新的曙光。棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)以植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生為基礎(chǔ)，進(jìn)行棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)理的細(xì)胞學(xué)以及分子生物學(xué)相關(guān)研究就顯得尤為重要。
　　 MADS-box基因家族編碼一類特異性轉(zhuǎn)錄因子，它們?cè)谥参锇l(fā)育的諸多過(guò)程中均發(fā)揮著非常重要的作用。該家族基因編碼的蛋白質(zhì)N末端均具備一個(gè)高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，約60個(gè)氨基酸大小。AGL15是

3、MADS-box基因家族中的一個(gè)亞家族成員，研究表明該家族基因在植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，不過(guò)，在棉花中的研究尚未見報(bào)道。本研究利用同源克隆技術(shù)從陸地棉中克隆獲得4個(gè)AGL15家族基因，主要研究結(jié)果如下:
　　 1.陸地棉GhAGL15基因的克隆及生物信息學(xué)分析
　　 利用擬南芥AtAGL15氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，以陸地棉CCRI cDNA為模板，進(jìn)而通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得目的基因。對(duì)得到的四個(gè)目的基因序列分

4、別進(jìn)行生物信息學(xué)分析，主要包括序列分析、多重序列比對(duì)以及進(jìn)化樹構(gòu)建等。結(jié)果表明它們均屬于A GL15亞家族成員，并分別命名為GhAGL15-1、GhAGL15-2、GhAGL15-3和GhAGL15-4。
　　 2.陸地棉GhAGL15轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位分析
　　 將目的基因GhAGL15-1、GhAGL15-2、GhAGL15-3和GhAGL15-4分別構(gòu)建35S-GhAGL15-GFP瞬時(shí)表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

5、將融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細(xì)胞，進(jìn)行顯微觀察。綠色熒光蛋白信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的分布情況表明它們均定位子細(xì)胞核。
　　 3.陸地棉GhAGL15基因的表達(dá)模式分析
　　 熒光定量結(jié)果表明，在非胚性器官（根、莖、幼葉和花瓣）中，GhAGL15-1、GhAGL15-2、GhAGL15-3和GhAGL15-4基因在莖和葉中的表達(dá)量極低;然而在花瓣中均具有較高的表達(dá)量。GhAGL15-2是唯一在根中具有較高表達(dá)量的基因，GhAGL15

6、-1、GhAGL15-3和GhAGL15-4在根中的表達(dá)量均非常低。在體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中，GhAGL15-1基因在胚性愈傷組織中的表達(dá)量最高;GhAGL15-2基因在愈傷組織中的表達(dá)量相對(duì)較低，表達(dá)量在胚性愈傷組織發(fā)育階段持續(xù)增加，在胚性愈傷組織發(fā)育的后期達(dá)到峰值。GhAGL15-3和GhAGL15-4基因的表達(dá)水平穩(wěn)定增加，在胚性愈傷組織發(fā)育后期達(dá)到最高后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。GhAGL15-1、GhAGL15-2、GhAGL15-3和Gh

7、A GL15-4在胚狀體四個(gè)時(shí)期（球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉形胚）的表達(dá)量均表現(xiàn)出最低，有的甚至很難檢測(cè)出表達(dá)量的存在。
　　 4.陸地棉GhAGL15-3基因啟動(dòng)子的克隆及生物信息學(xué)分析
　　 采用同源克隆方法，克隆得到GhAGL15-3基因啟動(dòng)子序列，其長(zhǎng)為1232bp。分析可能存在的基礎(chǔ)啟動(dòng)子區(qū)域有兩處。預(yù)測(cè)TSS在第1047bp處的T。含有分生組織表達(dá)響應(yīng)元件、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件以及干旱脅迫響應(yīng)元