陸地棉遺傳轉(zhuǎn)化體系建立及色素相關(guān)基因功能初步研究.pdf

1、目的：天然彩色棉又稱有色棉，是棉纖維具有天然色彩的一類特殊棉花，屬陸地棉(2n=52)。因彩色棉纖維具有天然色彩，無(wú)需人工染色，既節(jié)省生產(chǎn)成本又減少環(huán)境污染，近年來(lái)受到社會(huì)關(guān)注和科研單位的重視。但是目前天然彩色棉只有棕色和綠色兩種，顏色單一，嚴(yán)重制約了天然彩色棉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此利用基因工程改良天然彩色棉纖維色澤具有重要意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)選取天然彩色棉新彩棉5號(hào)和新彩棉7號(hào)為植物材料，（1）克隆了天然彩色棉無(wú)色花色素雙加氧酶基因

2、（GhLDOX）全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步研究；（2）通過(guò)體胚發(fā)生途徑建立了新彩棉7號(hào)的再生體系，為利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法對(duì)天然彩色棉纖維色澤和品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：（1）通過(guò)RACE技術(shù)獲得無(wú)色花色素雙加氧酶基因（GhLDOX）的全長(zhǎng)cDNA序列；（2）構(gòu)建GhLDOX基因的植物過(guò)表達(dá)載體并通過(guò)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化了煙草，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行檢測(cè)。（3）構(gòu)建GhLDOX基因的原核表達(dá)載體，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠

3、電泳，對(duì)該基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了分析；（4）以新彩棉5號(hào)和7號(hào)為植物材料，以MSB培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中激素及培養(yǎng)條件進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和分化，獲得了新彩棉7號(hào)再生植株。
　　 結(jié)果：（1）獲得的無(wú)色花色素雙加氧酶GhLDOX基因1323bp的全長(zhǎng)cDNA序列，其ORF 1062bp，編碼一個(gè)含354個(gè)氨基酸的多肽鏈。在NCBI網(wǎng)站同源比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)其屬類黃酮無(wú)色花色素雙加氧酶類；（2）將Pzp35S-GhLDOX植物過(guò)

4、表達(dá)載體通過(guò)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草，并通過(guò)PCR檢測(cè)獲得了轉(zhuǎn)基因煙草；（3）通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，對(duì)構(gòu)建的PET28a＋-GhLDOX載體的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析，在IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)該基因開(kāi)始表達(dá)蛋白質(zhì)，6小時(shí)最高；（4）通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中激素及培養(yǎng)條件，獲得了新彩棉7號(hào)的再生植株，建立了新彩棉7號(hào)的再生體系。
　　 結(jié)論：（1）利用5’RACE技術(shù)克隆獲得了彩色棉類黃酮無(wú)色花色素雙加氧酶GhLDOX基因的全長(zhǎng)cDNA序列；（2）G