陸地棉GhSH1a基因克隆及功能的初步分析.pdf

1、棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，是天然纖維的主要來源。對棉花基因功能的研究將為其遺傳改良提供理論依據(jù)。本研究從陸地棉(GossypiumhirsutumL.)cDNA文庫中篩選到一個(gè)SINA同源基因，命名為GhSH1a。序列分析表明該GhSH1acDNA全長1394bp，擬編碼339個(gè)氨基酸。GhSH1a蛋白與果蠅SINA和人類SIAH有30％左右的相似性，GhSH1a蛋白與擬南芥中的SINAT5有78％的相似性。SINA(Seveninabse

2、ntia)蛋白家族成員的共同結(jié)構(gòu)特征是具有高度保守的N-端C3HC4Ringfinger結(jié)構(gòu)域。SINA蛋白通過這個(gè)結(jié)構(gòu)域使靶蛋白質(zhì)泛素化并隨后被蛋白酶體降解，C-端序列具有與其他蛋白結(jié)合的功能。 SINA基因最初是在果蠅中克隆到。果蠅的SINA蛋白在眼睛R7感光細(xì)胞命運(yùn)決定過程中起著關(guān)鍵的作用。哺乳動(dòng)物SIAH1參與細(xì)胞的程序性死亡。擬南芥SINAT5具有泛素蛋白連接酶E3活性，弱化生長素信號，控制植株側(cè)根的發(fā)育。然而，對棉

3、花SINA同源蛋白功能的研究還未見報(bào)道。根據(jù)已知SINA蛋白的功能，尤其是擬南芥SINAT5的功能，以及生長素對棉纖維細(xì)胞和植物側(cè)根分化和發(fā)育的重要調(diào)節(jié)作用，推測本研究中的GhSH1a可能調(diào)控棉花側(cè)根的發(fā)育，或影響棉纖維細(xì)胞的分化、伸長。 本研究根據(jù)GhSH1acDNA的5’-和3’-末端序列設(shè)計(jì)引物，以棉花基因組DNA為模板擴(kuò)增出GhSH1a的基因片段，然后將該片段克隆到pGEM-TEasy載體中進(jìn)行測序。將GhSH1a的基

4、因序列與cDNA序列比較發(fā)現(xiàn)，該基因長2631bp，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成。 通過RT-PCR進(jìn)行組織表達(dá)特異分析，發(fā)現(xiàn)GhSH1a在根、莖、葉、花、5DPA、10DPA、15DPA的纖維中都有轉(zhuǎn)錄；在根、花、5DPA纖維中轉(zhuǎn)錄水平稍高。說明GhSH1a蛋白在各種組織中是必需的，而在分化程度較高的組織中有較高水平的表達(dá)。因此推斷GhSH1a可能與細(xì)胞分化有關(guān)。 分別以GhSH1acDNA5’-末端212bp和3

5、’-末端451bp序列為探針與基因組DNA酶切片段進(jìn)行Southernblot雜交分析，結(jié)果顯示5’-末端的探針雜交的信號條帶較少，表明5’-末端序列有較高的特異性；而3’-末端序列雜交的帶較多，表明3’-末端序列較保守。表明棉花基因組中至少含有兩個(gè)GhSH1a同源基因。 為了分析該基因產(chǎn)物在棉花組織發(fā)育過程中的功能，構(gòu)建了可被雌二醇β-estradiol誘導(dǎo)的植物RNA干擾表達(dá)質(zhì)粒pER8-GhSH1a-RNAi。利用農(nóng)桿菌

6、介導(dǎo)法將GhSH1a-RNAi片段轉(zhuǎn)化到棉花細(xì)胞中，以敲除基因組中內(nèi)源GhSH1a的表達(dá)，觀察和分析轉(zhuǎn)基因棉株的表型變化。獲得了7個(gè)GhSH1a-RNAi轉(zhuǎn)基因株系，PCR和Southernblot雜交檢測都證明GhSH1a-RNAi穩(wěn)定整合到棉花基因組中。7個(gè)轉(zhuǎn)基因系中有3個(gè)育有種子。β-estradiol誘導(dǎo)GhSH1a-RNAi表達(dá)的T1代6天無菌苗的側(cè)根比野生型的較長，根系較發(fā)達(dá)。側(cè)根被剪去之后，轉(zhuǎn)基因無菌苗的側(cè)根再生能力也比野

7、生型的強(qiáng)。根據(jù)轉(zhuǎn)基因棉株的這一表型變化初步分析，GhSH1a-RNAi的表達(dá)促進(jìn)側(cè)根的發(fā)育，即GhSHla抑制棉花側(cè)根的發(fā)育。這說明GhSH1a的功能與擬南芥中的SINAT5抑制側(cè)根發(fā)育的功能是一致的。 將對T1代植株的棉纖維表型包括纖維強(qiáng)度和長度等做進(jìn)一步的研究，以分析GhSH1a-RNAi的表達(dá)是否在纖維的發(fā)育過程起作用。該研究的意義在于確定GhSH1a是否與棉花纖維的發(fā)育或者與根系發(fā)育有關(guān)，以便通過基因工程改善棉花纖維品