豬瘟病毒感染對宿主細胞免疫應答基因的影響.pdf

1、豬瘟病毒(CSFV)是一種帶有囊膜的單股正鏈RNA病毒，與牛病毒性粘膜腹瀉病毒和羊邊界病毒同屬于黃病毒科瘟病毒屬。豬瘟病毒的基因組大小約12.3 kb，只含有一個開放閱讀框，編碼一個由3898個氨基酸殘基組成的多聚蛋白，該多聚蛋白在宿主細胞蛋白酶和病毒特異的蛋白酶共同作用下裂解為4個結(jié)構(gòu)蛋白和8個非結(jié)構(gòu)蛋白。家豬和野豬是該病毒的唯一宿主，豬瘟病毒引起的豬瘟是一種具有高發(fā)病率和高死亡率的烈性接觸性傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，世界衛(wèi)

2、生組織OIE將其列為A類必須申報的重要動物傳染病之一，我國也將豬瘟定為一類動物傳染病，并從2008年起列為動物疫病強制免疫項目。
　　 隨著豬瘟疫苗的廣泛使用，改變了豬瘟病毒的生態(tài)環(huán)境，豬瘟在流行特點和發(fā)病特點上發(fā)生了很大的變化，由大流行轉(zhuǎn)變?yōu)榈胤叫粤餍谢蛏l(fā)，臨床癥狀從典型轉(zhuǎn)變?yōu)榉堑湫?，出現(xiàn)母豬繁殖障礙和新生仔豬先天感染。從精液、睪丸、扁桃體和淋巴結(jié)中檢測到豬瘟病毒的存在，甚至在部分免疫了的豬體內(nèi)檢出豬瘟病毒，證實了豬瘟病毒存

3、在持續(xù)感染現(xiàn)象。病毒要實現(xiàn)潛伏或持續(xù)性感染，必需逃脫宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，突破宿主抗病毒防衛(wèi)機制而獲得免疫逃逸。研究豬瘟病毒與宿主之間的相互作用關系是理解病毒致病機制及其免疫應答的基礎，豬瘟病毒在宿主體內(nèi)或體外對靶細胞的影響正是它們相互作用的具體表現(xiàn)。PK-15細胞是豬瘟病毒體外感染的主要傳代細胞，探索豬瘟病毒對PK-15細胞功能的影響，將有助于揭示豬瘟病毒感染的致病機制。因此，在本研究中應用real-time RT-PCR和Wester

4、n blot方法對CSFV感染后宿主細胞的免疫應答基因表達的變化進行了研究，主要結(jié)果如下:
　　 1.建立了檢測豬免疫應答基因mRNA表達水平的real-time RT-PCR方法。
　　 根據(jù)已知的豬源SLA-2、TAP1、SLA-DR、Ii、CD40、CD80、CD86、IFN-α、IFN-β、GAPDH基因和CSFV5'UTR基因片段的mRNA序列，采用生物軟件Oligo6.0和Primer5.0輔助設計并合成了1

5、1對特異性引物;以Oligo(dT)18為引物，合成第一鏈cDNA;以cDNA為模板，分別進行11個目的基因片段的PCR擴增;膠回收PCR產(chǎn)物，把它們克隆到pMD18-T載體上并測序;對提取的重組質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋作為標準模板進行PCR擴增，同時對熒光定量PCR反應的引物濃度和退火溫度進行優(yōu)化。應用11對引物分別擴增出目的基因目的條帶，大小與預期片段相符合;real-timeRT-PCR反應的最佳引物濃度是202.5 nmol/μl

6、，最佳退火溫度是60℃;目的基因real-time RT-PCR融解曲線均顯示單一溶解峰。結(jié)果表明，本試驗成功地建立了檢測PK-15細胞中SLA-2、TAP1、SLA-DR、Ii、CD40、CD80、CD86、IFN-α、IFN-β、GAPDH和CSFV5'UTR基因mRNA表達動態(tài)的實時熒光定量PCR方法。
　　 2.應用real-time RT-PCR方法檢測豬瘟病毒感染后不同時間段的PK-15細胞中免疫應答基因的mRNA轉(zhuǎn)

7、錄情況。
　　 在自然和實驗環(huán)境下，豬瘟病毒能逃避宿主的免疫系統(tǒng)建立持續(xù)性感染。猜測，與MHC和細胞因子調(diào)控有關的一些基因卷入到免疫逃避事件中，但是具體的每一個基因在感染了CSFV后有什么變化尚不清楚。因此，用不同感染量豬瘟病毒Shimen毒株和GXXJ01毒株分別感染PK-15細胞，感染后1、3、12、24、36和48 h應用real-time RT-PCR方法檢測細胞中免疫應答基因SLA-2、TAP1、SLA-DR、Ii、C

8、D40、CD80、CD86、IFN-α和IFN-β的mRNA表達動態(tài)。結(jié)果顯示，SLA-2、TAP1、SLA-DR、Ii、CD40、CD80和CD86的mRNA表達呈現(xiàn)明顯的下調(diào)，其中SLA-DR和Ii的mRNA下調(diào)特別顯著，IFN-α和IFN-β的mRNA表達沒有明顯變化，表明CSFV可能參與了抑制免疫應答基因表達的機制。
　　 3.豬瘟病毒感染對宿主細胞中SLA-DR表達的影響。
　　 PK-15細胞感染豬瘟病毒Sh

9、imen毒株后，細胞內(nèi)SLA-DR蛋白表達呈現(xiàn)明顯的下調(diào)，在病毒感染后的24和36h檢測不到SLA-DR蛋白，在感染后的48 h檢測到少量的SLA-DR蛋白。為了探討豬瘟病毒誘導的SLA-DR的分子機制，從豬瘟病毒Shimen毒株中擴增出C、Npro和E2基因，將其與真核表達載體pcDNA3.0連接，成功構(gòu)建了P-C、P-Npro和P-E2重組真核表達質(zhì)粒。構(gòu)建成功的3個真核表達質(zhì)粒應用脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染方法進行體外細胞表達，轉(zhuǎn)染后的1、

10、3、12、24、36和48 h檢測細胞中SLA-DR的表達情況。結(jié)果顯示，分別轉(zhuǎn)染真核表達質(zhì)粒P-E2和P-C后，PK-15細胞中SLA-DR的轉(zhuǎn)錄水平有所升高;轉(zhuǎn)染真核表達質(zhì)粒P-Npro后，PK-15細胞中SLA-DR的表達在3～24 h顯示升高，24 h后開始下降，36 h后恢復到與對照組一致的水平;在蛋白質(zhì)水平對PK-15細胞中SLA-DR蛋白表達進行了檢測，發(fā)現(xiàn)分別轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染P-C、P-E2和P-C/P-E2后，細胞中SLA

11、-DR蛋白的表達有比較明顯的提高;轉(zhuǎn)染P-C/P-NPro/P-E2后，細胞中SLA-DR蛋白的表達量稍有上升;分別轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染P-Npro、P-C/P-Npro、P-NPro/P-E2后，PK-15細胞中SLA-DR蛋白的表達明顯下降。表明豬瘟病毒E2和C兩個基因單獨或協(xié)同作用對宿主細胞SLA-DR的下調(diào)表達沒有顯著影響，Npro基因?qū)K-15細胞中SLA-DR的表達有一定的抑制作用。研究認為，病毒病的發(fā)生、發(fā)展是多基因、多步驟、多