烏頭類中藥遺傳毒性研究.pdf

1、烏頭類中藥在中醫(yī)治療中已被廣泛使用，具有強(qiáng)心、升壓、鎮(zhèn)痛、抗炎等多種藥理作用，該類藥物毒性很大，常用藥物生川烏、生草烏、生附子屬于國家特殊管理的毒性中藥。目前烏頭類中藥在文獻(xiàn)中廣泛報(bào)道的主要有心臟毒性和中樞神經(jīng)毒性，而有關(guān)遺傳毒性的報(bào)道尚未查見。 本課題選用目前新藥遺傳毒性評價(jià)中推薦使用的三種試驗(yàn)(小鼠骨髓微核試驗(yàn)、鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)、體外CHL細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn))分別對生川烏、生草烏提取物及鹽附子進(jìn)行遺傳毒性研究。在此

2、基礎(chǔ)上，選用目前公認(rèn)的更為靈敏的單細(xì)胞凝膠電泳法(彗星試驗(yàn))檢測鹽附子是否存在DNA損傷作用。 小鼠骨髓微核試驗(yàn)每種受試藥物各設(shè)三個(gè)劑量組、陰性對照組(蒸餾水)和陽性對照組(環(huán)磷酰胺40 mg/kg)。生川烏給藥劑量分別26.00、13.00、6.50g生藥/kg、生草烏給藥劑量為16.60、8.30、4.15 g生藥/kg、鹽附子給藥劑量為15.45、7.73、3.86 g生藥/kg，藥物劑量組和陰性對照組經(jīng)口灌胃給藥，每天1

3、次，連續(xù)4天，最后一次給藥24 h后處死小鼠，取小鼠胸骨骨髓制片；陽性對照組于處死前一天一次性腹腔注射環(huán)磷酰胺，動(dòng)物處死及制片方法同藥物組和陰性對照組。所有骨髓涂片經(jīng)姬姆薩染色后讀片，計(jì)數(shù)1000個(gè)多染紅細(xì)胞的微核發(fā)生率。同時(shí)計(jì)數(shù)200個(gè)多染紅細(xì)胞和正染紅細(xì)胞，求出多染紅細(xì)胞/正染紅細(xì)胞的比值。試驗(yàn)結(jié)果顯示：陰性對照組微核發(fā)生率為1.75％。陽性組微核發(fā)生率為35。5％，陽性對照組與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)

4、果說明試驗(yàn)系統(tǒng)可靠。三種受試物各劑量組小鼠骨髓多染紅細(xì)胞微核率與陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；試驗(yàn)結(jié)果表明： 在本實(shí)驗(yàn)室條件下，生川烏、生草烏提取物及鹽附子小鼠骨髓微核試驗(yàn)呈陰性。 Ames試驗(yàn)選用兩種方法：直接法和代謝活化法。試驗(yàn)菌株為鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TAl00、TAl02、TAl535。生川烏、生草烏提取物及鹽附子在試驗(yàn)中各設(shè)6個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)白發(fā)回復(fù)突變對照組、陽性對照組

5、。試驗(yàn)結(jié)果表明：在加與不加肝微粒體酶(S9)的條件下，TA97、FA98、TAl02、TAl00、TAl535的自發(fā)回變菌落數(shù)均在正常范圍內(nèi)，各菌的陽性對照均高于相應(yīng)的白發(fā)回變菌落數(shù)兩倍以上。試驗(yàn)結(jié)果顯示：三種受試藥物在試驗(yàn)中劑量均為5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156mg生藥/皿，各劑量組TA97、TA98、TAl02、TAl00、TAl535的回變菌落數(shù)均未高于相應(yīng)菌株自發(fā)回變菌落數(shù)的兩倍，且無劑量反應(yīng)關(guān)系。本試

6、驗(yàn)結(jié)果表明：在本實(shí)驗(yàn)室條件下，生川烏、生草烏提取物及鹽附子在加或不加S9時(shí)均未見引起TA97、TA98、TAl00、TAl02、TAl535試驗(yàn)菌株基因突變，即Ames試驗(yàn)陰性。試驗(yàn)重復(fù)一次，所得結(jié)論相同。 體外CHL細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)也選用兩種方法：直接法和代謝活化法。三種受試藥物均設(shè)5個(gè)濃度組，陰性對照及陽性對照組。生川烏、生草烏在試驗(yàn)中兩種方法均采用的處理終濃度為5、2.5、1.25、0.625、0.313mg生藥/ml。

7、鹽附子不加S9時(shí)處理終濃度為5、2.5、1.25、0.625、0.313mg生藥/ml，加S9時(shí)處理終濃度為2.5、1.25、0.625、0.313、0.156mg生藥/ml。直接法：分別作用24h和48 h，陽性對照采用0.25μg/ml絲裂霉素C處理；代謝活化法;作用24 h和48h，每瓶添加0.5mlS9混合液，受試藥物處理6h后換液，陽性對照采用環(huán)磷酰胺25μg/ml處理。分別于染毒后24h和48h制片，姬姆薩染色法染片，顯微鏡

8、下觀察200個(gè)中期相細(xì)胞染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的改變。直接法和代謝法試驗(yàn)結(jié)果顯示：在兩種方法中三種提取物作用24 h及48 h，各給藥組細(xì)胞染色體畸變率均<5％，與陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示生川烏、生草烏提取物及鹽附子在加或不加S9時(shí)均未引起CHL細(xì)胞的染色體畸變，試驗(yàn)結(jié)果為陰性。試驗(yàn)重復(fù)一次，所得結(jié)論相同。由于鹽附子在一般毒性試驗(yàn)中毒性較生川烏和生草烏大，且在微核試驗(yàn)中顯示出最高的微核發(fā)生率(2.23±

9、1.36‰)，因此本研究選擇鹽附子進(jìn)行彗星試驗(yàn)，處理終濃度分別為5、2.5、1.25、0.625、0.3 13mg生藥／ml，將收獲的細(xì)胞采用PBS懸浮染毒的方法，受試藥物處理2h后，鋪于凝膠上裂解然后電泳。試驗(yàn)結(jié)果顯示陽性對照組與陰性對照組彗星細(xì)胞率和DNA遷移長度相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，鹽附子各個(gè)劑量組中彗星細(xì)胞率和DNA遷移長度與陰性對照組比較無顯著性差異(P>0.05)，因而可以認(rèn)為鹽附子在此實(shí)驗(yàn)條件下無DNA損傷