“黃海2號”中國對蝦高通量SNP篩選及其與抗WSSV性狀的關聯(lián)分析.pdf

1、中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)是我國重要的經(jīng)濟蝦類,WSSV制約我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。傳統(tǒng)對蝦選擇育種模式與分子標記輔助育種技術相結合有利于中國對蝦抗病品種的選育。單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)被認為是很有應用前景的分子標記技術。本研究在中國對蝦轉錄組454高通量測序的基礎上,依據(jù)預測的SNP位點設計引物,利用非標記探針 HRM(High Reso

2、lution Melting)技術,對單核苷酸突變進行驗證開發(fā)。利用開發(fā)的132個SNP標記(實驗室前期開發(fā)39個+本論文開發(fā)93個),對2008-2012年中國對蝦抗WSSV性狀測試實驗中獲得的抗性群體和敏感群體進行了遺傳多樣性分析,并對各位點基因型與抗WSSV性狀進行了關聯(lián)分析,獲得了與抗WSSV性狀相關的9個SNP標記。使用RT-PCR結合RACE技術對抗WSSV相關SNP位點Contig1401-67 TA所在基因——中國對蝦醛

3、縮酶基因(aldolase)進行了成功克隆,并獲得了該基因cDNA全長序列。
　　具體內(nèi)容如下:
　　一、中國對蝦多態(tài)性SNP位點開發(fā)
　　中國對蝦轉錄組454高通量測序、contig的拼裝和SNP位點的預測由國家人類基因組南方研究中心完成。依據(jù)預測的SNP位點,從造成錯義突變(mis-sence)的SNP位點中挑選了530個位點,共設計合成引物378組,篩選得到候選SNP位點301個并設計非標記探針,通過非標記探針H

4、RM分型方法,在96尾2012年人工選育的“黃海2號”中國對蝦群體中進行檢測和驗證,結果共有93個SNP位點顯示多態(tài)性。每個SNP位點的觀測等位基因數(shù)(Na)均為2個,有效等位基因數(shù)(Ne)分布范圍1.0105~2.000,觀測雜合度(Ho)的分布范圍為0.000～0.9792,期望雜合度(He)的范圍為0.0104～0.5026,次要等位基因頻率(MAF)分布范圍0.0052～0.5000。多態(tài)信息含量分析顯示93個位點的PIC,其平

5、均值為0.2182,低于標準值0.5。Shannon信息指數(shù)分布范圍為0.0326～0.6931,平均值為0.3330。研究結果表明,通過HRM技術對中國對蝦候選SNP位點進行驗證開發(fā)是一種有效的方法,開發(fā)獲得中國對蝦SNP位點可用于后續(xù)實驗研究。
　　二、中國對蝦抗WSSV相關SNP位點的篩選及關聯(lián)分析
　　利用132個SNP位點對“黃海2號”中國對蝦抗性群體和敏感群體進行HRM基因分型分析,并對基因型分布頻率進行卡方檢驗

6、。結果顯示,有9個SNP位點的10個基因型在抗性群體和敏感群體中分布頻率差異顯著(P﹤0.05),其中C1401-67TA的A/A型、C7695-204AG的A/G型、C283-145AG的G/G型、C12355-592CT的C/C型在兩群體中差異極顯著(P﹤0.01),C6625-56CT的C/T型、C7911-209CT的T/T型、C9733-231TA的T/A型、C12698-488CA的A/A型、C364-89AT的A/A型和C

7、12355-592CT的C/T型差異顯著(P﹤0.05)。進一步分析顯示,位點C1401-67TA的A/A型、C6625-56CT的C/T型、C364-89AT的A/A型和C12355-592CT的C/T型與抗病正相關,C7695-204AG的A/G型、C7911-209CT的T/T型、C9733-231TA的T/A型、C12698-488CA的A/A型、C283-145AG的G/G型和C12355-592CT的T/T型與抗病負相關。<

8、br>　　借助NCBI網(wǎng)站BlastX程序對獲得的與抗病性狀相關的9個Contig進行分析,推測其潛在功能。除了Contig12698,其余8個Contig均匹配到了序列相似度較高的功能基因(E值<10-10),分別是果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(fructose-1,6-bisphosphate aldolase),脫氧胞苷酸脫氨酶(deoxycytidylate deaMase),u5小核核糖核蛋白200解旋酶樣蛋白(u5 small

9、 nuclear ribonucleoprotein200 kda helicase-like protein),甘氨酸脫羧酶(glycine decarboxylase),多態(tài)縮多氨酸(DEAD-box polypeptide39),半胱氨酸天冬酶(effector caspase),肽轉運蛋白家族1-like(predicted:peptide transporter family1-like),40S核糖體蛋白S2(40S rib

10、osomal protein S2)。
　　三、中國對蝦SNP類型特征及分布特點
　　在中國對蝦轉錄組454高通量測序的基礎上,依據(jù)測序獲得的7萬余個可能的SNP位點和經(jīng)過HRM驗證獲得的多態(tài)性SNP位點,分析中國對蝦堿基突變的類型及其與周圍堿基的相關性。結果表明,C/T突變類型最多,G/C突變類型最少,并且存在“轉換偏差”為2.0>0.5;隨著突變位點直接相鄰位置上A&T堿基個數(shù)的增加,該突變位點的轉換偏差逐漸降低;突變位

11、點發(fā)生突變前后堿基組成存在(G+C)/(A+T)偏差。
　　四、中國對蝦抗病相關基因克隆及全長序列分析
　　使用RT-PCR結合RACE技術對抗WSSV相關SNP位點Contig1401-67 TA所在基因——中國對蝦醛縮酶基因(aldolase)進行了成功克隆,并獲得了該基因cDNA全長序列。序列分析結果表明,該cDNA全長2127 bp,包含一個1098 bp的開放閱讀框,編碼365個氨基酸。通過對中國對蝦醛縮酶基因核苷