海藻酸微囊在鼠胚成纖維細胞及綿羊精原干細胞冷凍保存中的應用.pdf

1、精原細胞是雄性成體體內唯一能將遺傳信息完整傳遞給后代的二倍體細胞。隨著科學技術的發(fā)展，干細胞研究領域逐漸形成一個干細胞與再生醫(yī)學想結合的研究領域，其目的是將干細胞潛能應用到實踐中，為醫(yī)學的相關研究提供一個研究方向和平臺。但是精原干細胞冷凍保存效率低下嚴重限制了相關研究的進行，鑒于此，很多研究者開始從不同角度出發(fā)去尋求一個高效的冷凍保存方案。本研究立足新型生物材料的引入，在體外環(huán)境下構建一個微環(huán)境，直接對微環(huán)境下的細胞進行冷凍保存操作，以

2、期能提高細胞尤其是精原干細胞的冷凍保存效率。
　　1.海藻酸微囊的制作方法
　　海藻酸微囊是利用海藻酸鹽溶液遇到多種二價陽離子能交聯(lián)生成凝膠這一特性生成的。生成海藻酸微囊的方法包括高壓靜電微囊發(fā)生裝置制作法、毛細管破碎制作法、氣體吹噴制作法等，本文綜合各個方法的優(yōu)點和缺點。鑒于高壓靜電微囊發(fā)生裝置制作法具有操作方便、效率高、生成微囊大小均勻等優(yōu)點，本研究采用高壓靜電微囊發(fā)生裝置制作海藻酸微囊。生成了大小均一，形態(tài)完整，直徑在

3、300μm左右的海藻酸-Ca2+微囊，所得微囊能用于細胞的包埋和進一步的相關研究。
　　2.海藻酸微囊替代DMSO和FBS的STO細胞冷凍保存研究
　　目的:改進現(xiàn)有的細胞冷凍保存方法，建立一個不含二甲基亞砜(DMSO)和血清(FBS)的高效冷凍保存方法，為細胞治療等臨床實踐提供優(yōu)質細胞。方法:設五個實驗組:藻酸微囊包埋STO細胞不含DMSO和FBS的冷凍保存（微囊D-F-）、添加10％DMSO和20％FBS的組(D+F+)

4、、僅添加10％DMSO的組(D+F-)、僅添加20％FBS(D-F+)、DMSO和FBS均不添加組(D-F-)。在冷凍前后對各實驗組細胞用臺盼蘭染色，進行細胞計數(shù)，計算細胞存活率，同時利用溴乙錠的二聚物(EthD)、鈣黃綠素-AM（Calcein-AM）進行染色觀察細胞的形態(tài)，且進一步驗證細胞存活率;解凍復蘇后用MTT法評估細胞的增殖速度和生長活力。結果:冷凍保存30d后對各組的細胞數(shù)量、細胞存活率、細胞形態(tài)和解凍復蘇后細胞的生長活力進

5、行比較發(fā)現(xiàn)，海藻酸微囊包埋冷凍組的細胞數(shù)、細胞存活率、細胞形態(tài)和生長活力均與添加DMSO和FBS的組之間無顯著性差異，而與其它三個對照組呈顯著性差異。結論:使用海藻酸微囊替代DMSO和FBS保存STO細胞，能有效的維持細胞形態(tài)、數(shù)量、存活率，同時不影響細胞的生長活力，從而建立了一個不含DMSO和FBS的高效冷凍保存方法。
　　3.用海藻酸微囊法冷凍保存綿羊精原干細胞
　　細胞冷凍保存技術是動物研究的重要組成部分。本研究首次應

6、用海藻酸微囊冷凍保存綿羊精原干細胞(SSCs)，旨在提高綿羊SSCs的冷凍保存效率。在綿羊SSCs液氮凍存1d后對綿羊SSCs進行存活率評估、細胞生長增值能力比較和CDH1、PLZF、GFRα1、OCT-4、Thy-1五個精原干細胞特異分子標記基因的免疫熒光鑒定。結果表明，在液氮凍存1d后，單細胞懸液凍存組綿羊SSCs活率為58.4％±1.4％，海藻酸微囊包埋凍存組為78.7％±1.3％，同時海藻酸微囊包埋凍存組細胞恢復生長增值能力明顯

7、好于單細胞懸液凍存組，解凍培養(yǎng)四d，海藻酸微囊組細胞數(shù)為2.1×105cells/孔，顯著高于單細胞懸液凍存組(1.1×105cells/孔)。解凍復蘇培養(yǎng)后進行細胞免疫熒光鑒定，發(fā)現(xiàn)在微囊包埋凍存1d后CDH1、PLZF、GFRα1、OCT-4、Thy-1均顯示陽性。在液氮凍存10d后，海藻酸微囊組綿羊SSCs存活率仍然維持在78.0％±1.5％，與液氮凍存1d時細胞存活率（78.7％±1.3％）和凍存前細胞存活率（82.2％±1.9

8、％）相比沒有顯著下降，而在單細胞懸液凍存組中，細胞存活率從82.2％土1.9％一直下降到液氮凍存1d的58.4％±1.4％和液氮凍存10d的48.1％±0.8％。也就是說海藻酸微囊包埋綿羊SSCs細胞進行冷凍保存，細胞的存活率不會隨著液氮凍存時間的增加而顯著下降，同時凍存10d后綿羊SSCs仍然保持著快速恢復生長增值能力，表達綿羊SSCs的特異標記基因。綜上所述，海藻酸微囊的應用顯著提高了綿羊SSCs的冷凍保存效率，且對綿羊SSCs的標