CPIV3單克隆抗體的制備及其阻斷ELISA檢測方法的建立.pdf

1、山羊副流感病毒3型（Caprine parainfluenza virus type3，CPIV3）是單股負(fù)鏈RNA病毒，與HPIV3和BPIV3一樣，都屬于副粘病毒科（Paramyxoviridea），副粘病毒亞科（Paramyxovirinea），呼吸道病毒屬（Respirvirus）。2013年，江蘇和安徽部分羊場育肥山羊爆發(fā)了一種以呼吸道癥狀為主的傳染病，從發(fā)病山羊樣品中，首次分離到一株新的PIV3病毒，命名為CPIV3。由于目

2、前沒有高效、快速、特異的CPIV3抗體檢測方法，為檢測該病在羊群中的流行情況，急需建立一種血清學(xué)檢測方法，為開展流行病學(xué)調(diào)查提供依據(jù)。
　　本研究利用超離濃縮純化的CPIV3病毒免疫6~8周齡雌性Balb/c小鼠，經(jīng)過3次免疫和1次加強免疫后，取免疫小鼠脾臟與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進行融合。通過間接ELISA方法進行雜交瘤細(xì)胞的篩選，連續(xù)3次亞克隆后獲得了2株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2E6和4A4。兩株單抗的細(xì)胞培養(yǎng)上

3、清和腹水的效價分別為5.12×102和2.56×105，5.12×102和1.28×105，Western Blot和IFA實驗證明兩種單抗具有良好的特異性，能與CPIV3發(fā)生特異性反應(yīng)。初步利用2E6和4A4單抗進行阻斷ELISA檢測，結(jié)果顯示單抗2E6的陽性血清檢出率為34/35，與此同時4A4檢出率為19/35。表明單抗2E6在檢測CPIV3抗體時具有特異性阻斷作用，該單抗的制備為CPIV3阻斷ELISA檢測方法的建立提供了基礎(chǔ)。

4、
　　通過方陣滴定法逐步優(yōu)化CPIV3阻斷ELISA的最佳反應(yīng)條件，其最佳反應(yīng)條件為以1：400倍稀釋的純化濃縮病毒（血凝價為213）為包被抗原；1：5倍稀釋的待檢血清樣品作用時間45 min；1：900倍稀釋的單抗2E6作用30 min；1：4000倍稀釋的酶標(biāo)二抗作用30 min；底物顯色8 min。通過檢測162份經(jīng)中和試驗驗證CPIV3抗體的山羊血清，利用ROC曲線法進行特異性和敏感性分析，確定阻斷ELISA反應(yīng)的臨界值為

5、35.45％，在此臨界值時，特異性和敏感性為98.8%，與病毒中和試驗結(jié)果符合率為98%，高于血凝抑制試驗與中和試驗的符合率，其中檢測中和抗體效價大于1：16的血清符合率為100%，用該阻斷ELISA方法檢測BDV陽性血清和PPRV陽性血清，結(jié)果均為陰性，以上結(jié)果證明該方法具有良好的特異性和敏感性。通過阻斷ELISA方法重復(fù)檢測8份血清，變異系數(shù)均小于10%，且均不影響結(jié)果的判定，證明該方法具有好的重復(fù)性。用本方法檢測CPIV3攻毒試驗