金紋細(xì)蛾Ⅰ型幾丁質(zhì)酶的表達(dá)、純化及酶學(xué)活性測(cè)定.pdf

1、幾丁質(zhì)由N-乙酰氨基葡萄糖殘基通過(guò)β-1，4糖苷鍵結(jié)合而成的直鏈多聚物，是昆蟲(chóng)外骨骼、腸道、氣管及圍食膜等的主要組成成分。昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶是一種能夠?qū)锥≠|(zhì)水解成為寡聚物的內(nèi)切酶，廣泛存在于昆蟲(chóng)的中腸、蛻皮液及某些昆蟲(chóng)的毒腺中，在昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中精確的調(diào)節(jié)著幾丁質(zhì)的代謝。目前，昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶主要應(yīng)用在病蟲(chóng)害防治、疾病控制及幾丁質(zhì)生物垃圾的降解等方面。
　　 本研究首次將金紋細(xì)蛾Ⅰ型幾丁質(zhì)酶(LrCHT5)基因分別構(gòu)建到原核表達(dá)載體

2、pRSET-C、pET28a、pET32a及pMAL-s上，進(jìn)行原核載體的篩選，期望能夠獲得表達(dá)可溶性蛋白的載體。利用分子生物學(xué)常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法構(gòu)建重組載體，將其分別轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的表達(dá)感受態(tài)中，利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明構(gòu)建的重組BL-pET28a-LrCHT5及BL-pET32a-Lr CHT5表達(dá)的蛋白以包涵體形式存在，重組BL-pRSET-LrCHT5沒(méi)有表達(dá)出目的蛋白，重組BL-pMAL-LrCHT5表達(dá)出

3、110kDa左右的可溶性融合蛋白MBP-Lr CHT5。Western blot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證明重組BL-pMAL-LrCHT5菌表達(dá)出可溶性融合蛋白。為了使融合蛋白能夠高效表達(dá)，本研究對(duì)重組pMAL-LrCHT5菌液的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳表達(dá)條件最終優(yōu)化為菌液OD值為0.778，誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)的過(guò)程中采用16℃過(guò)夜誘導(dǎo)。對(duì)于表達(dá)的MBP-LrCHT5蛋白采用4℃與Amylose柱過(guò)夜結(jié)合進(jìn)行純化，S

4、DS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示純化出純度較高的MBP-LrCHT5融合蛋白。利用膠狀幾丁質(zhì)及4MU-(GlcNAc)3作為底物均未檢測(cè)到活性。
　　 由于重組BL-PMAL-LrCHT5表達(dá)的融合蛋白MBP-LrCHT5在純化的過(guò)程中及生物學(xué)活性方面存在問(wèn)題，本研究將LrCHT5基因構(gòu)建到載體pFastBacTMDual上，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化入DH10Bac感受態(tài)中，獲得重組穿梭載體Bacmid-LrCHT5，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)

5、胞并進(jìn)行細(xì)胞表達(dá)。由于LrCHT5本身含有信號(hào)肽區(qū)，所以在表達(dá)的過(guò)程中分泌到細(xì)胞培養(yǎng)液中。表達(dá)結(jié)束后，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行收集透析，利用Ni-NTA柱進(jìn)行蛋白分離純化，SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示純化得到單一條帶的純化蛋白。
　　 本研究對(duì)原核和Sf9細(xì)胞表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行酶學(xué)活性檢測(cè)。利用4MU-(GlcNAc)3作為底物，結(jié)果顯示，原核表達(dá)的融合蛋白不具酶學(xué)活性，Sf9細(xì)胞表達(dá)的目的蛋白的比活力為2.917U/μg，最佳溫度為5

6、0℃左右，最佳pH為6.0。高濃度的金屬離子Mn2+、Ca2+、Mg2+及Ba2+對(duì)LrCHT5蛋白具有不同程度的促進(jìn)作用，Cu2+對(duì)酶有較強(qiáng)的抑制作用，SDS酶的抑制作用最強(qiáng)。通過(guò)對(duì)LrCHT5蛋白的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果顯示Km為14.2μm/L，Vmax值為0.905μM/min。另外，對(duì)純化的LrCHT5蛋白進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明LrCHT5蛋白對(duì)青霉及酵母分別存在不同程度的抑制作用。本課題深入研究了LrCHT5的生化性質(zhì)，為L(zhǎng)