姜黃素對朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶活性及基因表達(dá)的影響.pdf

1、朱砂葉螨(Tetranychus cinnabarinus)可危害多種作物，是最重要的世界性經(jīng)濟(jì)害螨之一。該螨具有世代周期短、繁殖能力強(qiáng)等生物學(xué)特性，這種螨的特性加上長期以來化學(xué)殺螨劑的大量使用，使“3R”問題日益嚴(yán)重，因此迫切需要開發(fā)尋找高效低毒的新型螨類控制劑。植物源殺螨活性物質(zhì)，易溶于水，對非標(biāo)靶生物低毒，無殘留，還可通過非目標(biāo)生物體生物降解，因此，這些化合物成為新型螨類控制劑的重要選擇對象之一。姜黃素(curcumin)主要提取

2、于中藥植物姜黃(Curcuma longa)，研究發(fā)現(xiàn)，其對朱砂葉螨表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性。天然產(chǎn)物農(nóng)藥研究室為驗證姜黃素的殺螨活性，進(jìn)行了大量的生物活性測定實驗，發(fā)現(xiàn)經(jīng)姜黃素處理后，螨出現(xiàn)大量失水、體表皺縮等死亡癥狀，這些癥狀表現(xiàn)說明姜黃素可能作用于螨的體壁結(jié)構(gòu)。幾丁質(zhì)是螨體壁的主要組成成分，其合成和降解在螨的生長發(fā)育過程中有至關(guān)重要的作用。但是目前對姜黃素的致死機(jī)制研究多集中在解毒酶系活性的變化，而其對幾丁質(zhì)的合成和降解酶系的影響尚未

3、研究報道。本研究以幾丁質(zhì)酶為切入點，從生理生化及分子水平兩個方面研究了姜黃素處理下朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶的變化，從而推測對幾丁質(zhì)降解的影響，以期為探明姜黃素對朱砂葉螨的作用機(jī)制提供依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.測定了姜黃素對朱砂葉螨雌成螨的觸殺毒力，得到了各亞致死劑量利用玻片浸漬法測得姜黃素處理朱砂葉螨48h后的毒力回歸方程為y=-0.474+1.234x，LC50為2.424mg/mL，95％的置信區(qū)間為1.715～3.733mg

4、/mL。48h后的亞致死劑量即LC40、LC30、LC20、LC10分別為1.511、0.911、0.504和0.222mg/mL。測定了各亞致死劑量姜黃素處理下對朱砂葉螨發(fā)育歷期的影響。結(jié)果表明，朱砂葉螨卵期、幼螨期、若螨期和成螨期與對照相比總體上呈縮短的趨勢，并無顯著差異，但是雌成螨的平均壽命顯著縮短。
　　2.明確了朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶的基本酶學(xué)性質(zhì)利用改良的schales法，研究了朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶的基本酶學(xué)性質(zhì)，包括最適反應(yīng)溫

5、度及熱穩(wěn)定性、最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性、金屬離子對酶活性的影響和動力學(xué)常數(shù)Km值。朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度約為35℃，對高溫比較敏感；最適反應(yīng)pH約為7.0，在pH值為6.0時最穩(wěn)定；金屬離子對幾丁質(zhì)酶活性存在影響，大部分的金屬離子對酶有較強(qiáng)的抑制作用，但也有少數(shù)的金屬離子對酶有激活作用；水解膠狀幾丁質(zhì)的Km值為5.15μmol/L。這些研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了螨類相關(guān)幾丁質(zhì)酶生物學(xué)特性研究，可為基于幾丁質(zhì)酶的殺螨劑篩選奠定理論基礎(chǔ)。

6、
　　在測定了朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測定了螨不同發(fā)育階段酶活性的情況。分析結(jié)果表明，卵期酶比活力最低，若螨期酶比活力最高，且卵期和若螨期具有顯著性差異。這可能因為幼螨和若螨期是螨蛻皮發(fā)育的階段，急需幾丁質(zhì)酶發(fā)揮作用，促進(jìn)幾丁質(zhì)的降解。用不同濃度姜黃素處理朱砂葉螨雌成螨24h后，隨著濃度的升高幾丁質(zhì)酶比活力不斷降低，在2.0和4.0mg/mL時與對照相比已存在顯著差異，特別在4.0mg/mL，對幾丁質(zhì)酶的抑制率達(dá)到

7、了約32%。由此推測，姜黃素的殺螨作用機(jī)制可能與幾丁質(zhì)酶有關(guān)。
　　3.克隆并分析了6條朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶基因(chitinase，TcCHTs)的cDNA序列參考朱砂葉螨近緣種二斑葉螨(Tetranychus urticae)的全基因組信息，利用RT-PCR技術(shù)，克隆獲得了6條TcCHTs的cDNA序列。這6條基因分別命名為TcCHIT1、TcCHIT2、TcCHIT3、TcCHT4、TcCHT5和TcCHT6，GenBank登錄

8、號分別為KT956964、KT956965、KT956966、KT956967、KT956968和KT9569692。6條幾丁質(zhì)酶基因的結(jié)構(gòu)域存在差異：其中TcCHIT1、TcCHIT2、TcCHIT3和 TcCHT4推導(dǎo)的氨基酸序列含有一個信號肽、一個催化結(jié)構(gòu)域和一個幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)域，而TcCHT5和TcCHT6由跨膜域代替了信號肽。預(yù)測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分別為60.80、69.03、104.32、59.75、45.63和49.05kDa，等

9、電點分別為5.44、8.65、6.23、6.07、6.12和8.27。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示這6條基因與各自相對應(yīng)的二斑葉螨基因聚在同一支上。
　　4.測定了朱砂葉螨TcCHTs基因在不同發(fā)育階段及姜黃素處理后表達(dá)量的差異在完成了對6條TcCHTs克隆與分析的基礎(chǔ)上，利用RT-qPCR測定了其在朱砂葉螨不同發(fā)育階段的表達(dá)量。結(jié)果顯示，幼螨和若螨期的基因表達(dá)量顯著高于卵期和成螨期，其中TcCHIT1、TcCHIT2、TcCHIT3