產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細(xì)菌的鑒定及產(chǎn)酶和酶學(xué)性質(zhì)的研究.pdf

1、農(nóng)業(yè)和林業(yè)上遇到的病害幾乎都是由昆蟲和真菌引起的，仔細(xì)研究不難發(fā)現(xiàn)，這兩大類的一個(gè)非常重要的共同點(diǎn)，那就是其外屏蔽都是由幾丁質(zhì)組成的。所以，在發(fā)現(xiàn)了化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境和人類造成的不可彌補(bǔ)的重大災(zāi)害后，人們把注意力朝向了生物防治，因而幾丁質(zhì)的分解主力—幾丁質(zhì)酶就無疑地成了人們的研究重點(diǎn)。幾丁質(zhì)酶的來源多種多樣，有植物幾丁質(zhì)酶，動物幾丁質(zhì)酶和微生物幾丁質(zhì)酶，這其中由于微生物的各種特性，如體積小，面積大，吸收多，轉(zhuǎn)化快，生長旺，繁殖快，適應(yīng)強(qiáng)，易

2、變異，分布廣，種類多，基因提取和轉(zhuǎn)化的方便快捷等等，使其成為多數(shù)學(xué)者找尋幾丁質(zhì)酶的對象。因此，不斷地去尋找篩選產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物，并純化其所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶，研究其性質(zhì)、作用方式及其作用效果，是目前生物防治研究中的一個(gè)新的熱點(diǎn)。 以典型昆蟲(家蠶)為實(shí)驗(yàn)材料，從自然死亡個(gè)體的病患部位，即中腸圍食膜出發(fā)，分離篩選產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株。為了能使篩選幾率最大限度的提高，本試驗(yàn)所用的篩選培養(yǎng)基中僅以膠體幾丁質(zhì)作為唯一碳原，使只能利用膠體幾丁質(zhì)的菌株

3、才能在該平板上生長。在無菌條件下，用接種環(huán)將死亡個(gè)體中腸圍食膜病患部位組織搗碎，挑出，然后在幾丁質(zhì)平板上劃線，放置28℃培養(yǎng)，72 h后，平板中長出各種不同的能利用膠體幾丁質(zhì)的菌株，挑取水解圈/菌落直徑之比最大的菌落，得到一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細(xì)菌，命名為zl1-r。于同樣的膠體幾丁質(zhì)培養(yǎng)基平板上連續(xù)五代劃線，所得到的水解圈/菌落直徑比值變化不大，這說明該菌株具有穩(wěn)定的產(chǎn)酶傳代能力。本實(shí)驗(yàn)室對該菌株的保藏采用的是甘油速凍保存法和石蠟斜面保存法。

4、 為確定該菌株在生物防治中的作用，將zl1-f菌株接種于膠體幾丁質(zhì)培養(yǎng)基中純培養(yǎng)72h后，將發(fā)酵液稀釋1/2后分別以涂布法和噴灑法喂食家蠶、菜青蟲及草原蝗蟲，測定其生物防治效果，結(jié)果表明該菌株對家蠶、菜青蟲及稻蝗的致死率分別為50％、73.33％和60％。在證實(shí)了zl1-r菌株有生物防治效果后，對其進(jìn)行了菌種鑒定。結(jié)合傳統(tǒng)的表型分類、化學(xué)分類和現(xiàn)代的分子分類等細(xì)菌分類方法，對菌株zl1-r進(jìn)行了形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化及16

5、S rDNA序列分析。分子生物學(xué)鑒定的過程如下：細(xì)菌基因組的提取與純化；設(shè)計(jì)16S rDNA引物，通過PCR技術(shù)得到16S rDNA片斷；連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，涂布Amp平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑選陽性菌落，提取質(zhì)粒，酶切檢驗(yàn)等過程，將16S rDNA進(jìn)行測序分析。將得出的基因序列在Genebank登錄，根據(jù)測序結(jié)果，用RibosomalDatabase Project(RDP Ⅱ)核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，從RDP Ⅱ數(shù)據(jù)庫中選擇

6、15個(gè)同源性最高的模式菌株與zl1-r進(jìn)行進(jìn)化樹分析。通過形態(tài)學(xué)觀察，生理生化測定及分子生物學(xué)鑒定，初步將zl1-r菌株歸為氣單胞菌屬(Aeromonas spp.)。 為了能更好地了解并改善該菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的條件，本試驗(yàn)對該菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化分別是從發(fā)酵時(shí)間，發(fā)酵溫度，發(fā)酵起始pH值，培養(yǎng)基裝量，碳原，氮原等方面進(jìn)行的。經(jīng)過初步研究，發(fā)現(xiàn)該菌株的最佳誘導(dǎo)物為粉狀幾丁質(zhì)，其次為膠體幾丁質(zhì)，而片狀幾丁質(zhì)幾乎不被其利用。

7、通過各種條件下單因素的變化和均勻設(shè)計(jì)法對該菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，得出該菌株產(chǎn)酶的最適環(huán)境是：粉狀幾丁質(zhì)1.2％(w/w)，氮源蛋白胨0.12％(w/w)和K<,2>HPO<,4>0.02％(w/w)，發(fā)酵72 h，溫度為30℃，起始pH為8.0，培養(yǎng)基裝量為15％。本試驗(yàn)還對該菌株所產(chǎn)生的粗酶液的性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明該菌株所產(chǎn)的幾丁質(zhì)酶的最佳作用溫度為25℃，最佳的作用pH值是5.5，耐溫性較差，在45℃以上就喪失50％以上的