水稻基因和sRNA表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)研究與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建.pdf

1、生物體在時(shí)空條件下通過RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯、代謝物積累、表觀調(diào)控等協(xié)同作用，維系生物體的平衡，適應(yīng)多變的生存環(huán)境。在全基因組水平進(jìn)行表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)研究并構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以更全面地闡述基因或sRNA等在時(shí)空特異條件下的調(diào)控模式，探索基因與sRNA在表達(dá)調(diào)控中的上游調(diào)控因子與下游靶標(biāo)，挖掘基因和sRNA的功能，并揭示它們?cè)诰S系生物體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮的作用。
　　表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)(eQTL)分析就是把基因或sRNA等在群體中的表達(dá)量作為數(shù)量

2、性狀（即表達(dá)性狀）進(jìn)行QTL定位，檢測(cè)控制RNA表達(dá)變異的遺傳位點(diǎn)。不同于傳統(tǒng)的QTL定位，eQTL定位還可以鑒定表達(dá)性狀變異的調(diào)控模式即順式作用（cis-eQTL）或反式調(diào)控（trans-eQTL）。尋找控制表達(dá)性狀遺傳變異的trans-eQTL，即鑒定表達(dá)性狀的上游調(diào)控因子，是eQTL研究的一個(gè)重要的任務(wù)。同時(shí)，一個(gè)調(diào)控子的表達(dá)變異也可能定位到trans-eQTL，被其它因子所調(diào)控。這種多個(gè)表達(dá)性狀和其trans-eQTLs所揭示的

3、調(diào)控子和靶標(biāo)的相互關(guān)系便形成一種網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)，為調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建提供了最基本的元件。所以整合eQTL和共表達(dá)分析可以用來鑒定候選調(diào)控子，增加檢測(cè)的力度。本研究結(jié)果如下:
　　1.發(fā)芽72h苗期樣品eQTL研究
　　我們將珍汕97、明恢63以及由其雜種F1通過單粒傳多代自交獲得的重組自交系(110RILs)浸種催芽，取露白72h后的幼芽，提取RNA，與AffymetrixGeneChipRiceGenomeArray雜交并獲取全基

4、因組探針組信號(hào)值。利用601個(gè)重組bins的遺傳連鎖圖，和復(fù)合區(qū)間作圖方法(CIM)進(jìn)行全基因組eQTL定位。通過全基因組排列測(cè)驗(yàn)，獲得eQTL定位的LOD閾值3.12(P=0.05)。16，372個(gè)e-traits共獲得了26，051個(gè)eQTLs。其中4464個(gè)是cis-eQTLs，相對(duì)于trans-eQTLs，cis-eQTLs具有更大LOD值，并能解釋更多的表達(dá)量的變異。
　　eQTL并不是隨機(jī)分布在各個(gè)染色體上，在第三、第

5、五、第十染色體上出現(xiàn)了明顯的富集，可能存在eQTL熱點(diǎn)。我們以每1cM為區(qū)間，統(tǒng)計(jì)每個(gè)區(qū)間內(nèi)eQTL的個(gè)數(shù)，鑒定了171個(gè)潛在的熱點(diǎn)區(qū)，并對(duì)這些熱點(diǎn)區(qū)進(jìn)行GO功能富集分析。在所有可能的熱點(diǎn)區(qū)中，有21個(gè)GO類在37個(gè)熱點(diǎn)區(qū)中顯著富集。其中GO:0006259（DNA代謝）在5個(gè)熱點(diǎn)區(qū)都存在顯著的富集(Chr03:401-402cM、Chr05:717-718cM、Chr10:1205-1206cM、Chr10:1243-1244cM、C

6、hr10:1244-1245cM)。同時(shí)結(jié)合基因在群體水平的共表達(dá)分析鑒定了調(diào)控這些DNA代謝相關(guān)基因的候選調(diào)控子。
　　通過計(jì)算所有定位到cis-eQTL的4464個(gè)表達(dá)性狀與其置信區(qū)間內(nèi)共定位的trans-eQTLs所對(duì)應(yīng)e-traits的表達(dá)相關(guān)性，鑒定了99個(gè)基因與多于30個(gè)具有trans-eQTLs共定位的e-traits顯著共表達(dá)。其中有24個(gè)基因與100-425個(gè)具有trans-eQTLs共定位的e-traits顯著

7、共表達(dá)，而這些最顯著的候選調(diào)控子并不是轉(zhuǎn)錄因子，因此非轉(zhuǎn)錄因子基因也可以在全基因組基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。
　　通過比較苗期干重QTL定位的LOD值曲線和eQTL熱點(diǎn)圖譜，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)表型QTL和eQTL的熱點(diǎn)區(qū)有重疊，而且重疊區(qū)域內(nèi)大量共定位的eQTLs對(duì)應(yīng)的表達(dá)性狀與表型性狀值顯著相關(guān)，該表型可能是由大量基因的相互調(diào)控導(dǎo)致的。
　　2.水稻見穗期劍葉eQTL的研究
　　本研究利用水稻全基因組芯片獲取珍汕97、明恢

8、63以及其重組自交系群體(210RILs)的見穗期劍葉組織的表達(dá)譜，并結(jié)合1619個(gè)重組bins圖譜定位控制水稻劍葉時(shí)期基因表達(dá)變異的遺傳因子，即表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)(eQTLs)。了解控制各表達(dá)性狀變異的作用模式（cis-eQTL及trans-eQTL），鑒定trans-eQTLs調(diào)控?zé)狳c(diǎn)，并構(gòu)建水稻時(shí)空特異性的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　以探針組在至少三分之一的RILs中表達(dá)為篩選閾值，獲得了21，929個(gè)具有MSUV6.1注釋的表達(dá)

9、性狀（e-traits）。結(jié)合1619個(gè)重組bins標(biāo)記構(gòu)成的高密度圖譜，進(jìn)行全基因組eQTL定位。10，725個(gè)e-traits共獲得13，647個(gè)eQTLs，包括37.2％的順式作用的eQTLs，以及62.8％的反式調(diào)控的eQTLs。根據(jù)物理圖譜和遺傳圖譜的分布，有4條染色體上的eQTL數(shù)比期望的要多，可能存在eQTL分布熱點(diǎn)。通過卡方測(cè)驗(yàn)檢測(cè)每個(gè)bin中實(shí)際定位的trans-eQTLs和期望的trans-eQTLs以及超幾何測(cè)驗(yàn)檢

10、測(cè)每個(gè)bin中觀測(cè)到的trans-eQTLs和定位到cis-eQTL的e-traits，共獲得了138個(gè)顯著的trans-eQTL熱點(diǎn)bins(P＜0.01)。
　　通過整合見穗期劍葉eQTL對(duì)應(yīng)的e-traits的表達(dá)圖譜和基因注釋（功能相關(guān)的基因，如GO分類等）以及一種擴(kuò)展的迭代組合分析方法可以對(duì)控制基因表達(dá)變異的候選調(diào)控子進(jìn)行篩選。利用參與相同生物學(xué)功能的基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，可以幫助我們分析基因調(diào)控的上下游關(guān)系，并減少假陽性的

11、產(chǎn)生，有助于提高網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的可行性。通過GO注釋信息與文獻(xiàn)中提到的水稻開花相關(guān)基因與穗發(fā)育相關(guān)基因的收集，得到177個(gè)相關(guān)e-traits，共定位到170個(gè)trans-eQTLs和109個(gè)cis-eQTLs，其中61個(gè)cis-eQTLs的置信區(qū)間與至少一個(gè)開花相關(guān)trans-eQTLs共定位，被定義為group（候選調(diào)控子），與cis-eQTL共定位的trans-eQTLs所對(duì)應(yīng)的開花基因?yàn)槊總€(gè)group的members，是候選靶標(biāo)基因。

12、通過計(jì)算所有候選調(diào)控子和候選靶標(biāo)的表達(dá)相關(guān)性，利用iGA（迭代組合分析）的方法，我們鑒定了8個(gè)調(diào)控子，并根據(jù)調(diào)控子和靶標(biāo)基因之間的相互作用情況構(gòu)建了見穗期開花相關(guān)基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。為了確認(rèn)該網(wǎng)絡(luò)的真實(shí)性，我們利用珍汕97和珍汕97背景的Ghd7近等基因系NIL(mh7)的見穗期劍葉材料檢測(cè)了Ghd7下游靶標(biāo)的轉(zhuǎn)錄水平。約80％的統(tǒng)計(jì)結(jié)果能夠得到實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。
　　我們同樣將此策略運(yùn)用到產(chǎn)量相關(guān)的表型QTL。phQTLs和trans-e

13、QTLs熱點(diǎn)的重疊說明定位到熱點(diǎn)區(qū)的trans-eQTLs對(duì)應(yīng)的表達(dá)性狀或多或少都會(huì)與相應(yīng)的表型相關(guān)。有些直接控制某種農(nóng)藝性狀，有些則通過作用于某些基因與該性狀相關(guān)，而有的則是因?yàn)樵撔誀畹漠a(chǎn)生導(dǎo)致了基因表達(dá)的變化，存在一種反饋調(diào)節(jié)。
　　3.sRNA在永久F2群體中的表達(dá)變異
　　表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)在發(fā)掘控制基因表達(dá)水平的遺傳變異位點(diǎn)上已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，可以在全基因組水平鑒定特異的順式、反式調(diào)控區(qū)域，構(gòu)建基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

14、。eQTL定位的概念也可以擴(kuò)展到sRNA的表達(dá)變異，用來檢測(cè)控制群體中sRNA表達(dá)變異的遺傳組分。我們利用永久F2群體分析了sRNA在該群體中的表達(dá)變異、變異方式和特征，試圖解析調(diào)控sRNA表達(dá)變異的遺傳調(diào)控因子。
　　我們首先構(gòu)建了SNP替換的親本參考基因組。對(duì)所有的雜合材料，同時(shí)將reads比對(duì)到珍汕97參考基因組和明恢63參考基因組。最后比對(duì)的reads將分成三種類型。親本之間保守的sRNAs;在雜合材料中等位特異表達(dá)的sR

15、NAs;特異來源于某一親本的sRNAs。0.71％含有SNP位點(diǎn)的sRNAs和17％親本特異表達(dá)的sRNA與珍汕97和明恢63的遺傳多態(tài)性相關(guān)。
　　sRNA表達(dá)性狀在基因組上分布非常廣泛，大量的sRNA表達(dá)性狀都集中在基因啟動(dòng)子區(qū)（基因上游2kb）和基因3'端（基因下游500bp）。24nt的sRNAs在sRNA王國中是最豐富的，充分表現(xiàn)了其序列多態(tài)性，而21nt的sRNA具有更高的表達(dá)豐度?？偣灿?63，904個(gè)sRNAe-t

16、raits定位到81，096個(gè)sQTLs(eQTLsforsRNAe-traits)，其中45，438個(gè)sQTLs(56.0％)表現(xiàn)出顯著的顯性效應(yīng)(P＜0.05，1000permutations)。其中92.3％sQTLs位點(diǎn)呈現(xiàn)出顯著的負(fù)向顯性效應(yīng)，即調(diào)控sRNA表達(dá)變異的位點(diǎn)在雜合材料中的表達(dá)水平比中親值要低。揭示了群體中sRNA表達(dá)變異的顯性負(fù)調(diào)控模式，與中親值相比，更多的sRNA在雜合基因型材料中呈現(xiàn)出下調(diào)的趨勢(shì)。同時(shí)大約96

17、％的具有顯著超顯性效應(yīng)的sQTLs都是trans-sQTLs。認(rèn)為在水稻永久F2群體中，負(fù)向顯性的trans-sQTLs在sRNA的表達(dá)變異中發(fā)揮著主導(dǎo)作用。
　　不同于控制基因表達(dá)變異的eQTLs，cis-sQTLs同樣具有熱點(diǎn)，這是由sRNA表達(dá)性狀的富集產(chǎn)生的。共獲得了317個(gè)cis-sQTLs的熱點(diǎn)bins(p＜0.01)，最顯著的5個(gè)熱點(diǎn)區(qū)在第二、第三和第七染色體。同樣有385個(gè)bins是trans-sQTLs的熱點(diǎn)區(qū)。

18、最顯著的5個(gè)熱點(diǎn)在第四、第五和第九染色體。大多數(shù)cis-sQTLs和trans-sQTLs的熱點(diǎn)區(qū)都是不同的。對(duì)24nt的sQTL而言，最顯著的trans-sQTL熱點(diǎn)是Bin770(Chr05)和Bin635(Chr04)，而21nt的trans-sQTL熱點(diǎn)是Bin841(Chr06)和Bin449(Chr03)。
　　通過比較OsDCLs、OsAGOs和OsRDRs的eQTLs與trans-sQTL熱點(diǎn)共定位的情況，發(fā)現(xiàn)這些