牛GV期卵母細胞玻璃化冷凍技術優(yōu)化及其作用機制研究.pdf

1、牛GV期卵母細胞相對于成熟卵母細胞的冷凍保存要困難很多，但在遠距離運輸卵母細胞時，必須進行冷凍保存。因此，開發(fā)GV期卵母細胞冷凍保存技術對于充分利用未成熟卵母細胞、特別是遠距離屠宰場卵巢卵母細胞保存具有重要的現(xiàn)實意義。海藻糖(trehalose)是一種類似于蔗糖的非還原性雙糖，能形成玻璃狀保護層保護處于極端條件下的生命體，因此探索海藻糖作為非滲透性冷凍保護劑替代常規(guī)玻璃化冷凍保護劑(CPA)中蔗糖、用于冷凍保存GV期卵母細胞的可能性，并

2、找到最適替代濃度是本研究的目的之一。有研究證明，常規(guī)溶解冷凍保護劑的緩沖介質(zhì)DPBS（杜氏磷酸鹽緩沖液）中的主要成分NaCl，對胚胎的超低溫冷凍具有一定的危害，但其對卵母細胞尤其是GV期卵母細胞的保護作用未見報道。因此，本研究的目的之二，是以氯化膽堿代替NaCl，以及聯(lián)合海藻糖和氯化膽堿用于GV期卵母細胞的冷凍保存，探索其保護效果。此外，本研究的目的之三，是研究冷凍損傷的機制，凋亡基因和周期基因相對表達量的差異性。
　　 研究內(nèi)

3、容和結(jié)果如下:
　　 1.不同濃度海藻糖對牛GV期卵母細胞玻璃化冷凍的效果
　　 (1)在對不同濃度海藻糖作為非滲透性保護劑對卵母細胞存活能力評價的實驗中，發(fā)現(xiàn)冷凍組中0.5M海藻糖組活力強的比率不如0.5M蔗糖組(39.8％vs52.5％，p＜0.05)，但是0.5M海藻糖組的總的存活的卵母細胞比率比0.5M蔗糖組高(70.1％ vs63.6％，p＜0.05)，其他冷凍組之間無顯著差異。
　　 (2)在CPA中

4、添加不同濃度海藻糖后透明帶硬度測定實驗中，0.5M蔗糖組中透明帶溶解時間（93±2.5min）顯著少于其他冷凍組，0.5M海藻糖組(95.5±2.6min)、0.3M海藻糖組（93.3±3.8min）除外(p＜0.05)。
　　 (3)卵母細胞發(fā)育能力與對照組相比，冷凍顯著降低了胚胎的卵裂率和囊胚率(p＜0.05)，1M海藻糖組、0.8M海藻糖組、0.1M海藻糖組冷凍保存的卵母細胞不能發(fā)育到囊胚期，0.5M蔗糖組與0.5M海藻糖

5、組、0.3M海藻糖組胚胎的卵裂率和囊胚率差異不顯著(p＞0.05)，且0.5M蔗糖組（13.9±2.3％）和0.5M海藻糖組（12.2±0.9％）、0.3M海藻糖組(10.4±2.8％)的胚胎卵裂率顯著高于其它組（0.8M海藻糖組（7.7±4.3％）除外）(p＜0.05);0.5M蔗糖組（2.5±2.2％）和T3（1.5±1.3％）、0.3M海藻糖組（1.3±2.2％）的囊胚率要高于其它組，但差異不顯著。
　　 (4)檢測體外培

6、養(yǎng)成熟的卵母細胞的紡錘體形態(tài)，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冷凍保護劑中濃度相同(0.5mol/L)兩種糖具有類似保護效果，冷凍液中添加不同濃度的海藻糖會起到不同程度的保護作用。
　　 實驗結(jié)論:海藻糖可以作為蔗糖的替代物用于GV期卵母細胞玻璃化冷凍，0.3mol/L-0.8mol/L均能達到一定的保護作用，但0.5mol/L為最適宜替代濃度。
　　 2.牛GV期卵母細胞冷凍損傷的分子機制
　　 (1)通過細胞凋亡檢測試劑盒免疫

7、熒光染色法檢測卵母細胞凋亡，實驗結(jié)果表明:0.5M蔗糖組（4.1±0.9％）、0.5M海藻糖組（5.5±2.6％）卵母細胞未凋亡的比率顯著低于(p＜0.05)新鮮卵組（13.0±0.9％）;
　　 (2)通過檢測細胞凋亡相關基因BAX inhibitor和BA，以及細胞周期相關基因CDC2和CyclinB1的mRNA相對表達量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過凍融的卵母細胞，其mRNA表達水平明顯受到影響，凋亡基因BAX和周期相關基因CDC2表達水平上

8、調(diào)，另兩個表達水平總體下調(diào)。
　　 實驗結(jié)論:冷凍引起GV期卵母細胞凋亡加劇，冷凍損傷主要是通過引起凋亡的途徑進行的。
　　 3.改良磷酸鹽緩沖液(mPBS)配制玻璃化冷凍液卵母細胞冷凍效果評價
　　 （1) CPA中氯化鈉以氯化膽堿替代后，卵母細胞成活率0.5M蔗糖組(24.2％)顯著低于對照組(90.4％)、mPBS+0.5M蔗糖組(42.2％)和mPBS+0.5M海藻糖組(47.0％)(p＜0.05)。mP

9、BS+0.5M蔗糖組和mPBS+0.5M海藻糖組在統(tǒng)計學上差異不顯著，但后者高于前者(p＞0.05)。
　　 （2) CPA中氯化鈉以氯化膽堿替代后，透明帶溶解時間冷凍組0.5M蔗糖組(103±4.16 min)顯著長于mPBS+0.5M海藻糖組(86.67±5.69min)和mPBS+0.5M蔗糖組(89.00±9.54min)(p＜0.05)。
　　 （3) CPA中氯化鈉以氯化膽堿替代后，卵母細胞成熟培養(yǎng)后體外受精

10、，受精胚胎的卵裂率，冷凍組顯著低于對照組(45.4±0.9％，p＜0.05)，mPBS+0.5M蔗糖組(28.4±0.5％)和mPBS+0.5M海藻糖組(26.8±2.1％)顯著高于0.5M蔗糖組(14.2±2.6％)(p＜0.05);囊胚率0.5M蔗糖組（2.3±2.0％）、mPBS+0.5M蔗糖組(3.2±0.1％)低于mPBS+0.5M海藻糖組（3.9±0.9％），三組在統(tǒng)計學上差異不顯著(p＞0.05)。
　　 實驗結(jié)論