抗嗜水氣單胞菌解淀粉芽孢桿菌的抗菌機(jī)理研究及其微膠囊制劑的安全性評(píng)價(jià).pdf

1、抗生素的濫用已經(jīng)引起了嗜水氣單胞菌日益嚴(yán)重的耐藥性問題,導(dǎo)致嗜水氣單胞菌引起的養(yǎng)殖魚類疾病的有效防治難度加大,因而尋求抗生素的理想替代品迫在眉睫。芽孢桿菌廣泛存在于自然界中,能夠形成內(nèi)生孢子,具有很強(qiáng)的抗逆性,不僅能夠防病治病,促進(jìn)動(dòng)物生長,而且具有無副作用、無殘留、無污染、不產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn),是替代抗生素的理想制劑,具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。鑒此,本研究篩選了一株抗嗜水氣單胞菌解淀粉芽孢桿菌優(yōu)良菌株G1,在確定了其對(duì)嗜水氣單胞菌及其引起的草

2、魚細(xì)菌性敗血癥具有良好抗菌防病效果的基礎(chǔ)上,通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)和抗菌相關(guān)基因檢測(cè)探討了其抗菌機(jī)制;優(yōu)化了其微膠囊的實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)工藝,并進(jìn)一步評(píng)價(jià)了微膠囊的耐酸、耐堿性能及其對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的安全性,為后續(xù)開發(fā)可替代抗生素的解淀粉芽孢桿菌微膠囊奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)果如下:
　　1.抗嗜水氣單胞菌解淀粉芽孢桿菌的分離及其對(duì)嗜水氣單胞菌的拮抗效果
　　從養(yǎng)殖池污泥中分離篩選了一株優(yōu)良的抗嗜水氣單胞菌芽孢桿菌 G1,通過API

3、50CH細(xì)菌鑒定系統(tǒng)以及16S rDNA序列分析法,菌株G1被鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),其16S rDNA序列(GenBank登錄號(hào):HM245965)與基因庫中芽孢桿菌屬菌株的16S rDNA序列有99％?100%的同源性,而且與解淀粉芽孢桿菌Ba-74501的16S rDNA序列(GenBank登錄號(hào):DQ422953)的親緣關(guān)系最近。菌株G1對(duì)病原性嗜水氣單胞菌具有廣譜拮抗活性,

4、對(duì)嗜水氣單胞菌的生長具有良好的抑制作用,對(duì)草魚抗嗜水氣單胞菌感染具有良好的效果。
　　2.抗嗜水氣單胞菌解淀粉芽孢桿菌的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　以抗嗜水氣單胞菌解淀粉芽孢桿菌G1的無抗菌活性突變株作為對(duì)照,利用雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)建立了解淀粉芽孢桿菌G1及其突變株菌體蛋白2-DE圖譜,并進(jìn)一步通過質(zhì)譜檢測(cè)和數(shù)據(jù)庫檢索鑒定了解淀粉芽孢桿菌 G1的差異蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,解淀粉芽孢桿菌G1的2-DE圖譜蛋白質(zhì)點(diǎn)為113

5、5個(gè),匹配率為89.37%;以解淀粉芽孢桿菌G1突變株的菌體蛋白2-DE圖譜作對(duì)照,解淀粉芽孢桿菌G1共有65個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn),其中36個(gè)高豐度的差異蛋白質(zhì)經(jīng)鑒定與蛋白質(zhì)合成與修飾、能量代謝、菌體抗逆自我保護(hù)、耐藥以及抗菌等生理功能有關(guān),揭示解淀粉芽孢桿菌G1除了其產(chǎn)生的抗菌蛋白直接參與抗菌作用外,其對(duì)環(huán)境的抗逆能力、生長性能對(duì)其抗菌作用也具有重要的意義。
　　3.抗嗜水氣單胞菌解淀粉芽孢桿菌的抗菌素相關(guān)基因分析
　　分別對(duì)抗

6、嗜水氣單胞菌的解淀粉芽孢桿菌 G1的抗菌素相關(guān)基因進(jìn)行了 PCR擴(kuò)增與測(cè)序,并對(duì)其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列、跨膜螺旋信號(hào)、結(jié)構(gòu)域與二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了預(yù)測(cè)與分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,菌株G1僅含有伊枯草菌素合成必需基因,該基因與GenBank基因庫中芽孢桿菌屬其他細(xì)菌的伊枯草菌素A、桿菌抗霉素D、抗霉枯草菌素等伊枯草菌素家族基因自然聚類,與枯草芽孢桿菌MH25株和RB14株的伊枯草菌素 A基因有98%的高度同源性,而且其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列與GenB

7、ank中芽孢桿菌屬其他細(xì)菌的伊枯草菌素、伊枯草菌素 A、脂肽類化合物bacillorin、芽孢菌素 D等抗菌物質(zhì)的氨基酸序列有高度同源性,與枯草芽孢桿菌MH25的伊枯草菌素A合成酶B(GenBank登錄號(hào):ABY89499)的親緣關(guān)系最近。此外,菌株G1伊枯草菌素合成必需基因的編碼產(chǎn)物不具有明顯的跨膜結(jié)構(gòu),但其結(jié)構(gòu)域中存在AMP結(jié)合位點(diǎn)和PP結(jié)合位點(diǎn),二級(jí)結(jié)構(gòu)中存在α螺旋、伸展鏈、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲。
　　4.抗嗜水氣單胞菌解淀粉芽

8、孢桿菌微膠囊的制備工藝與特性
　　以明膠為壁材,采用單因素法,考察了明膠濃度、進(jìn)風(fēng)溫度、進(jìn)料速度、空氣流量等因素對(duì)抗嗜水氣單胞菌解淀粉芽孢桿菌微膠囊有效含菌量的影響,并進(jìn)一步通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了解淀粉芽孢桿菌微膠囊制劑的噴霧干燥工藝參數(shù),觀察了其微膠囊顆粒形態(tài)以及對(duì)人工模擬胃液和腸液的耐受力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,解淀粉芽孢桿菌微膠囊噴霧干燥的最佳制備工藝條件為:明膠濃度為3.0%,進(jìn)風(fēng)溫度為155℃,進(jìn)料速度為8 ml/min,空氣流

9、量為700 L/h,各因素對(duì)解淀粉芽孢桿菌微膠囊噴霧干燥工藝的影響程度為:明膠濃度>進(jìn)料速度>空氣流量>進(jìn)風(fēng)溫度。此外,解淀粉芽孢桿菌微膠囊制劑的顆粒呈球形,表面有凹陷,但沒有孔和裂紋,顆粒粒徑分布基本均勻,平均大小為9.22μm,對(duì)人工模擬胃液和腸液具有較好的耐受力。
　　5.抗嗜水氣單胞菌解淀粉芽孢桿菌微膠囊的安全性評(píng)價(jià)
　　參照《GB/T21805-2008化學(xué)品藻類生長抑制試驗(yàn)》、《GB/T13266-91水質(zhì)物質(zhì)對(duì)

10、蚤類(大型蚤)急性毒性測(cè)定方法》、《GB/T13267-91水質(zhì)物質(zhì)對(duì)淡水魚(斑馬魚)急性毒性測(cè)定方法》、《漁藥臨床試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范》等國家標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)法規(guī),觀察了解淀粉芽孢桿菌微膠囊對(duì)小球藻生長抑制作用以及對(duì)大型蚤、斑馬魚和草魚的急性毒性,分析了其對(duì)養(yǎng)殖水體主要理化因子的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,解淀粉芽孢桿菌微膠囊在終濃度為0.2 mg/L~2000 mg/L時(shí)對(duì)小球藻生長具有促進(jìn)作用,對(duì)小球藻的半數(shù)抑制濃度大于2000 mg/L,而且其對(duì)大型

11、蚤、斑馬魚和草魚的半數(shù)致死濃度也大于2000 mg/L(或mg/Kg體重)。此外,在養(yǎng)殖水體中加入解淀粉芽孢桿菌微膠囊至終濃度為0.2 mg/L~2000 mg/L后14天內(nèi),各濃度組的氨氮含量、硫化物和pH值均緩慢下降,僅亞硝酸鹽氮含量稍微升高后逐漸緩慢降低,但這些理化因子的變化與解淀粉芽孢桿菌微膠囊的加入量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。因此,解淀粉芽孢桿菌微膠囊實(shí)際無毒,對(duì)養(yǎng)殖水中氨氮、亞硝酸鹽氮、硫化物和pH等理化因子的影響均控制在蝦虎魚仔魚、黃