攜帶黃龍病菌的柑桔木虱內(nèi)生細(xì)菌菌群多樣性分析及功能驗(yàn)證.pdf

1、柑桔黃龍病(HLB)是柑桔的一種毀滅性病害,目前尚無有效的防治方法,植株一旦染病,必須挖除病樹。其病原菌(Candidatus Liberibacter asiaticus,Ca.L.asiaticus)屬于韌皮部限制的α-變形菌門,目前尚未完成其體外培養(yǎng)。柑桔木虱(昆蟲綱,同翅目,木虱科)主要危害九里香和柑桔等蕓香科植物,其體內(nèi)存在豐富的內(nèi)生細(xì)菌,且是黃龍病病原菌在自然環(huán)境中的主要傳播媒介。
　　為了剖析柑桔木虱(Diaphor

2、ina citri)體內(nèi)可能與黃龍病菌(Ca.Liberibacter asiaticus)互作的內(nèi)生細(xì)菌,本文通過常規(guī)分離培養(yǎng)和基于16S rDNA的變性梯度凝膠電泳(16S rDNA-PCR-DGGE)方法,對(duì)不同木虱樣本中的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了比較研究,并通過q-PCR對(duì)兩種方法結(jié)果中的部分優(yōu)勢(shì)細(xì)菌進(jìn)行定量分析。
　　對(duì)黃龍病菌不帶菌木虱進(jìn)行了32次分離,帶菌木虱進(jìn)行了44次分離,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ca. L.asiaticus不帶菌木虱與

3、帶菌木虱中可培養(yǎng)內(nèi)生菌菌落豐富度和菌落形成單位均不同。在不帶菌木虱中,共獲得14株形態(tài)不同的菌株,經(jīng)16S rDNA-PCR及生理生化鑒定,分屬于芽孢桿菌屬(Bacillus,3株)、歐文氏菌屬(Erwinia,1株)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella,1株)、葡萄球菌屬(Staphylococcus,2株)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter,1株)、泛菌屬(Pantoea,2株)、果膠桿菌屬(Pectobacterium,1株)

4、、沙門氏菌屬等(Salmonella,1株)、鏈霉菌屬(Streptomyces,1株)、Massilia brevitalea(1株)等10個(gè)細(xì)菌屬。在帶菌木虱中分得的4株細(xì)菌在不帶菌木虱中均分離到,分屬于克雷伯氏菌屬、芽孢桿菌屬、果膠桿菌屬,最終得到了歐文氏菌屬等8種差異菌株,另外Dc-11(嗜氣芽孢桿菌)在Ca. L.asiaticus帶菌木虱和不帶菌木虱中分離頻率均達(dá)到100％,表明其為木虱體內(nèi)常駐優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。
　　基于柑桔

5、木虱內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA V6-V8區(qū)的變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)分析顯示:Ca.L.asiaticus帶菌木虱與不帶菌木虱內(nèi)生細(xì)菌存在差異;同一來源木虱的不同部位的內(nèi)生細(xì)菌也存在差異。其中優(yōu)勢(shì)條帶10(Wolbachia sp.)、12(Wolbachia pipientis)、13(Syncytium endosymbiont of Diaphorina citri)、14(Uncultured bacterium)、

6、19(Serratia marcescens)、21和22(均為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas maltophilia)在木虱體內(nèi)穩(wěn)定存在,在帶菌木虱腹部特有優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌為腸桿菌屬。本研究的木虱中也存在內(nèi)共生菌 Wolbachia(條帶1、10、12)且存在大量的不可培養(yǎng)細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,黃龍病菌對(duì)木虱內(nèi)生菌的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響,我們得到了檸檬酸桿菌屬、果膠桿菌屬等多種差異菌株。
　　綜合分析上述兩種方法得到的差異

7、菌株,選擇 Bacillus sp.、Salmonella sp.、Enterobacter sp.(其中,腸桿菌屬 Enterobacter sp.是在未獲得純培養(yǎng)菌株而在PCR-DGGE中檢測(cè)到的菌株之一,沙門氏菌屬Salmonella sp.是在不帶菌木虱中分離到而在PCR-DGGE中未檢測(cè)到的菌株之一,芽孢桿菌屬Bacillus sp.是在分離培養(yǎng)和PCR-DGGE均檢測(cè)到的菌株之一)在8個(gè)木虱樣品中進(jìn)行q-PCR分析(以樣品中

8、總細(xì)菌量作為校正),得出每種細(xì)菌的相對(duì)含量,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行 LSD檢驗(yàn),并以各種細(xì)菌相對(duì)含量的-Lg值作圖,先比較同一樣品中3種細(xì)菌分別與黃龍病菌的相對(duì)含量關(guān)系,再比較同種細(xì)菌在不同樣品中的共性,分析每個(gè)樣品中3種細(xì)菌和黃龍病菌的關(guān)系。
　　柑桔木虱體內(nèi)3種內(nèi)生細(xì)菌與 Ca.L.asiaticus的q-PCR檢測(cè)結(jié)果與分析:(1)Ca.L.asiaticus柑桔木虱樣品1-4號(hào)Ca.L.asiaticus相對(duì)量達(dá)到0.2％-3.56％

9、,而5-8號(hào)數(shù)量級(jí)為10-6-10-7,1-4號(hào)為陽性,5-8號(hào)為陰性;(2)Enterobacter sp.1-4號(hào)樣品其相對(duì)含量較5-8多3個(gè)數(shù)量級(jí),即在本實(shí)驗(yàn)的8個(gè)樣品中,Ca.L.asiaticus陽性樣品中Enterobacter sp.相對(duì)量較Ca.L.asiaticus陰性樣品中都多約103倍,故Enterobacter sp.與 Ca.L.asiaticus呈正相關(guān)。且在Ca.L.asiaticus陰性樣品中, Ca.L

10、.asiaticus和Enterobacter sp.的相對(duì)量均很少,數(shù)量級(jí)為10-5-10-7,結(jié)合q-PCR的方法特點(diǎn),可視為陰性;(3)Salmonella sp.相對(duì)含量不會(huì)隨Ca.L.asiaticus含量變化而變化,在8個(gè)樣品中相對(duì)含量均較低,數(shù)量級(jí)為10-4-10-7;(4)Bacillus sp.相對(duì)含量總體也較少,在各個(gè)樣品中含量差異小。此檢測(cè)結(jié)果解釋了各種細(xì)菌的在前期分離培養(yǎng)和PCR-DGGE中的結(jié)果,進(jìn)一步驗(yàn)證了前