中國(guó)柑桔主產(chǎn)區(qū)柑桔木虱細(xì)菌多樣性及內(nèi)共生菌Wolbachia系統(tǒng)發(fā)育研究.pdf

1、柑桔木虱（Diaphorina citri Kuwayama）主要取食危害九里香、柑桔嫩梢等蕓香科植物，是柑桔黃龍?。–itrus huanglongbing，HLB）傳播的主要媒介昆蟲。昆蟲體內(nèi)是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，存在大量的微生物。這些微生物對(duì)宿主發(fā)育，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和防御方面都起著重要的作用。本研究利用基于16SrRNA基因作為分子標(biāo)記的變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophor

2、esis，DGGE）的方法和基于16S rRNA基因的RFLP指紋圖譜法對(duì)我國(guó)部分地區(qū)野外采集的柑桔木虱體內(nèi)的微生物群落的多樣性進(jìn)行了研究，并對(duì)共生菌Wolbachia進(jìn)行了檢測(cè)及系統(tǒng)發(fā)育分析，期望找出對(duì)柑桔木虱的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要影響的細(xì)菌，為柑桔木虱的防治提供新的思路和理論依據(jù)。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 采用基于細(xì)菌16SrDNA的RFLP（Restriction Fragment Length Polymor

3、phism）方法對(duì)柑桔木虱體內(nèi)細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析。使用細(xì)菌通用引物對(duì)柑桔木虱體內(nèi)的細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的16S rDNA序列連接到pMD19-T載體中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中，建立16SrDNA的全長(zhǎng)克隆文庫(kù)。挑取的185個(gè)陽(yáng)性克隆子經(jīng)過三種限制性內(nèi)切酶RsaⅠ、MspⅠ和HaeⅢ消化后產(chǎn)生31個(gè)不同的片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism）圖

4、譜。將31種有差異的16S rRNA酶切圖譜進(jìn)行測(cè)序，與GenBank中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明：柑桔木虱體內(nèi)存在Pseudomonadaceae，Enterobacteriaceae，Xanthomonadaceae，Burkholderiaceae，Rickettsiaceae，Rhizobiaceae 等6個(gè)科的微生物，能夠鑒定到屬種的包括：Pseudomonas sp，Ralstonia sp，Pantoea sp，Serrat

5、ia sp，Wolbachia sp，Stenotrophomonas sp，Carsonellia ruddii以及Candidatus Liberibacter asiaticus（柑桔黃龍病菌），Syncytium endosymbiont（胞內(nèi)共生體），Secondary endosymbiont（初級(jí)共生體）。另外還有7個(gè)不同的不可培養(yǎng)細(xì)菌。Syncytium endosymbiont占16SrDNA克隆文庫(kù)的31％，為柑桔木

6、虱體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群。
　　 以基于細(xì)菌16SrRNA基因的變性梯度凝膠電泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）的方法對(duì)來自于不同地區(qū)及不同寄主的柑桔木虱體內(nèi)細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析。提取細(xì)菌基因組DNA，經(jīng)細(xì)菌16SrRNA可變區(qū)基因的通用引物PCR擴(kuò)增，DGGE分離后，回收測(cè)序了17條DGGE條帶。與GenBank中數(shù)據(jù)進(jìn)行了比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，得到Pseudomonadac

7、eae，Rickettsiaceae，Enterobcteriaceae，Xanthomonadaceae，Staphylococceae和Bacillaceae等科的微生物，能夠鑒定到屬的細(xì)菌有Bacillus sp，Staphylococcus sp，Wolbachia sp，Pantoea sp，Pseudomonas sp以及Syncytium endosymbiont（胞內(nèi)共生體）。Syncytium endosymbiont

8、（胞內(nèi)共生體）在所有柑桔木虱樣品中普遍存在且在DGGE圖譜中條帶最亮，是主要的優(yōu)勢(shì)菌群。DGGE圖譜顯示不同寄主植物及不同地區(qū)的柑桔木虱體內(nèi)細(xì)菌存在差異，而DGGE圖譜的聚類分析表明來自相同寄主植物的柑桔木虱體內(nèi)細(xì)菌群落差異相對(duì)較小。
　　 使用Wolbachia的16SrRNA（核糖體基因），ftsZ（細(xì)胞分裂基因）和wsp（細(xì)胞表面蛋白基因）的特異引物檢測(cè)了我國(guó)5個(gè)不同柑桔主產(chǎn)區(qū)來源的柑桔木虱受Wolbachia的感染情況，

9、將獲得的3段基因序列克隆測(cè)序，在GenBank中比對(duì)分析建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了5個(gè)不同來源的柑桔木虱體內(nèi)都有Wolbachia感染，3段基因的序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹均表明我國(guó)柑桔木虱體內(nèi)感染的Wolbachia屬于B大組，以wsp基因建立的系統(tǒng)發(fā)育樹還進(jìn)一步表明其Wolbachia屬于B大組的Con亞組。且不同地區(qū)來源的柑桔木虱體內(nèi)的Wolbachia的16SrRNA，ftsZ和wsp基因同源性都分別高達(dá)99％以上，差異非常小。

10、表明在不同地區(qū)的柑桔木虱體內(nèi)Wolbachia幾乎沒有差異。
　　 本研究的結(jié)果顯示了柑桔木虱體內(nèi)存在著大量的微生物，且不同地區(qū)及不同寄主植物的柑桔木虱體內(nèi)的細(xì)菌種類和數(shù)量存在一定的差異。我國(guó)各地柑桔木虱體內(nèi)均有Wolbachia感染，其感染的Wolbachia屬于B組的Con亞組并與灰飛虱和稻飛虱感染的有極高的同源性。這些結(jié)果可望能夠?yàn)榉治鰞?nèi)共生菌與昆蟲之間的關(guān)系，柑桔木虱體內(nèi)微生物與柑桔黃龍病菌之間的相互作用提供理論基礎(chǔ)，并