內(nèi)蒙古甘草內(nèi)生細(xì)菌多樣性研究.pdf

1、本文以甘草為研究材料，運(yùn)用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法并結(jié)合非培養(yǎng)方法PCR-DGGE技術(shù)，對采自內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)的野生及栽培甘草的不同部位內(nèi)生細(xì)菌的多樣性進(jìn)行了研究，比較了野生及栽培甘草不同部位內(nèi)生細(xì)菌群落的多樣性差異，并獲得了一批內(nèi)生細(xì)菌菌株資源。 對野生及栽培甘草根、莖、葉組織中的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離和計數(shù)，發(fā)現(xiàn)野生及栽培甘草根、莖、葉部位的內(nèi)生細(xì)菌菌落數(shù)分布在3.10×102～1.37×106(單位：cfu/g鮮重)上，總體來說，野

2、生甘草內(nèi)生細(xì)菌菌落數(shù)大于栽培甘草，內(nèi)生細(xì)菌在甘草根、莖、葉部位的菌落數(shù)和種群數(shù)量均有差異，野生及栽培甘草均表現(xiàn)出根和葉部的內(nèi)生細(xì)菌種類比莖部豐富。應(yīng)用分子方法ERIC-PCR方法對分離內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行菌株水平的多樣性檢測，共得到內(nèi)生細(xì)菌121株。對其中82株進(jìn)行16SrDNA片段測序分析，結(jié)果表明這些內(nèi)生細(xì)菌分別與Genbank中α、β、γ－Proteobacteria，F(xiàn)irmicutes、Actinobacteria五類細(xì)菌中的19個已

3、知屬相似性達(dá)到97-100％。其中γ-Proteobacteria和Firmicutes最多，分別占45.78％和42.17％，剩余的12.05％為其余三類。內(nèi)生細(xì)菌的主要優(yōu)勢種群為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、泛菌屬(Pantoeasp.)和沙雷氏菌屬(Serratiasp.)。 對同一批甘草樣品進(jìn)表面滅菌后，以CTAB法提取植物基因組DNA，用引物799f-1492r擴(kuò)增細(xì)

4、菌16SrDNA片段，應(yīng)用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)對內(nèi)生細(xì)菌菌群多樣行進(jìn)行分析。DGGE指紋圖譜顯示野生及栽培甘草不同生長部位的優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌較為相似，個別部位有其特有的優(yōu)勢菌。對其中的1-9號亮度較高的條帶回收并克隆測序，顯示他們與Genbank中γ-Proteobacteria類細(xì)菌中的Enterobactersp.、Pantoeasp.、Klebsiellaoxytoca、Serratiasp.相似性達(dá)到97％-100％。

5、 采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)方法對可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌及非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示可培養(yǎng)細(xì)菌的DGGE條帶未能與基因組內(nèi)生細(xì)菌中的條帶產(chǎn)生很好的對應(yīng)，可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌樣品條帶分布在凝膠中較高濃度梯度區(qū)域，而非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌條帶的范圍則分布在較低濃度梯度區(qū)域。在野生和栽培的根、莖、葉六組樣品中，僅有栽培莖(CS)中的分離菌株CS1b可以與其非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌中的的9號條帶(Pantoeaagglomerans)很好的對應(yīng)。