豬瘟強(qiáng)毒株與兔化弱毒疫苗株的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增鑒別檢測.pdf

1、豬瘟(classicalswinefever，CSF)是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒(classicalswinefevervirus，CSFV)引起的一種重大傳染病，具有很高的死亡率，對我國生豬產(chǎn)業(yè)造成巨大的損害。CSFV是單股正鏈RNA病毒，基因組大小約為12.3kb，編碼一個大的多聚體蛋白，蛋白酶將其裂解成12種蛋白，包括8種非結(jié)構(gòu)蛋白(P7、Npro、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B和4種結(jié)構(gòu)蛋白(囊膜糖蛋

2、白Erns、衣殼蛋白C、E1、E2)，其中，5'-UTR、3'-UTR、NS5B基因序列比較保守，而NS5B常用于CSFV基因分型。目前，我國豬瘟的防控主要采用豬瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)免疫，但是由于缺乏相應(yīng)的血清學(xué)標(biāo)志和配套的鑒別檢測方法，其在我國的大規(guī)模應(yīng)用，使得通過抗體檢測很難區(qū)分免疫弱毒和野毒感染，不利于豬瘟的凈化。
　　針對豬瘟病毒野毒感染與疫苗免疫鑒別診斷的關(guān)鍵問題，本研究參照GenBank中登錄的CSFV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株

3、（shimen、Alfort、Brescia等）、疫苗株(HCLV、ChineseC、Rimes等)、不同基因亞型的CSFV野毒株以及牛病毒性腹瀉病毒1型(BVDV-1)和牛病毒性腹瀉病毒2型(BVDV-2)的全基因組序列，利用DNAstar軟件系統(tǒng)比較分析豬瘟強(qiáng)弱毒株的序列差異，設(shè)計一套分別針對豬瘟弱毒與強(qiáng)毒的特異性環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）引物，優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，分別建立CSFV強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的LAMP檢測方法。結(jié)

4、果表明65℃恒溫作用50min即可完成LAMP擴(kuò)增，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物用羅丹明B指示劑肉眼觀察顏色變化，陽性呈黃色，陰性呈橙紅色;用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，陽性擴(kuò)增有特異性梯形條帶產(chǎn)生。經(jīng)檢測，豬瘟強(qiáng)毒株的特異性LAMP檢測方法對豬瘟弱毒疫苗及其他豬源病毒均無特異性擴(kuò)增，豬瘟弱毒疫苗株的LAMP檢測方法亦如此，特異性良好，同時建立的LAMP檢測方法比RT-PCR靈敏度高出1000倍，且重復(fù)性穩(wěn)定性良好。用建立的LAMP方法和RT-PCR方