PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)及其激活有效免疫應(yīng)答的研究.pdf

1、目的：對豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV表面蛋白GP2、GP3、GP4與GP5進(jìn)行高效原核表達(dá),純化后進(jìn)行動物免疫試驗(yàn),比較GP2、GP3、GP4、GP5及其組合的免疫學(xué)效應(yīng),探討其作為疫苗候選主要抗原的可能性
　　方法：根據(jù)Genbank中豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV JXA1株的已知序列,利用RT-PCR方法擴(kuò)增PRRSV ORF2、ORF3、ORF4和ORF5基因,分別插入原核表達(dá)載體 PET-32a,轉(zhuǎn)化 E.coli

2、進(jìn)行高效誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)親和層析純化后進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting實(shí)驗(yàn),鑒定正確的GP2、GP3、GP4、GP5純化蛋白按不同的組合方式,添加佐劑后對小鼠進(jìn)行單獨(dú)免疫和聯(lián)合免疫,檢測免疫原性;使用生物學(xué)信息學(xué)技術(shù),根據(jù)已知目的蛋白的序列對目的蛋白的結(jié)構(gòu)、同源性、抗原性作預(yù)測和分析。
　　結(jié)果：1) RT-PCR、酶切和測序結(jié)果顯示目的基因克隆成功且無突變, SDS-PAGE和Western blotting鑒

3、定結(jié)果中,均可觀察到特異性目的條帶,表明本實(shí)驗(yàn)正確表達(dá)了PRRSV表面蛋白GP2、GP3、GP4與GP5,并且親和層析實(shí)驗(yàn)后的GP2~5蛋白純度可達(dá)到90％。2)使用純化后的GP2~5四種蛋白對Balb/c小鼠進(jìn)行腹腔免疫試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)過程中小鼠沒有死亡,表面重組蛋白的安全性;收集小鼠血清對免疫結(jié)果進(jìn)行檢測分析并比對后顯示,四種蛋白均具有免疫源性,可刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答,其中,GP2的抗體效價(jià)最低,GP5抗體效價(jià)最高, GP2、GP3

4、、GP4同時(shí)免疫的抗體效價(jià)與GP5相接近,而GP2、GP3、GP4、GP5同時(shí)免疫后具有相對更高水平的抗體效價(jià)。3)三免1周后四種蛋白誘導(dǎo)的IgG水平明顯升高,且均誘導(dǎo)產(chǎn)生了sIgA;實(shí)驗(yàn)組 IgG1和 IgG2a的檢測結(jié)果均高于PBS組,且水平相對接近;同時(shí)檢測到分泌的細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4水平,結(jié)果表明四種表面蛋白GP2~5刺激機(jī)體同時(shí)誘導(dǎo)了體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　結(jié)論：表達(dá)出PRRSV JXA1株表面蛋白GP2、GP

5、3、GP4與GP5,作為亞單位疫苗的候選抗原進(jìn)行免疫檢測。通過單獨(dú)免疫試驗(yàn)顯示,PRRSV四種表面蛋白均有免疫原性,但免疫原性差距較大。通過聯(lián)合免疫試驗(yàn)顯示,GP2、GP3、GP4三種蛋白聯(lián)合免疫與GP5蛋白單獨(dú)免疫后的檢測結(jié)果沒有明顯差異,說明GP2、GP3、GP4三種結(jié)構(gòu)蛋白是以三聚體形式共同參與了免疫應(yīng)答反應(yīng)。綜合結(jié)果表明,GP5可單獨(dú)作為保護(hù)性抗原制備疫苗,GP2、GP3、GP4不適合單獨(dú)作為保護(hù)性抗原制備疫苗;而GP5與GP2