柑橘黃龍病病原菌共培養(yǎng)體系的構(gòu)建.pdf

1、黃龍病，其英文以漢字拼音 Huanglongbing命名的柑橘病害，由內(nèi)生的、只在篩管細胞生長的、難培養(yǎng)韌皮部桿菌（Candidatus Liberibacter spp.）所引起，目前我國只發(fā)現(xiàn)亞洲種韌皮部桿菌。柑橘黃龍病是世界柑橘產(chǎn)業(yè)的一種毀滅性病害，已經(jīng)造成巨大的經(jīng)濟損失。黃龍病病原菌的人工培養(yǎng)是攻克黃龍病病害的關(guān)鍵所在，迄今為止，國內(nèi)外投入了大量人力和物力研究柑橘黃龍病病原菌的人工培養(yǎng)，但仍無法獲得病原菌純培養(yǎng)，極大限制了對黃龍

2、病的病原學(xué)及其致病機理的研究以及病害防治。縱覽此前的研究大都受限于純培養(yǎng)的傳統(tǒng)思路，對靶標病原細菌難培養(yǎng)特性的本質(zhì)與成因認識存在誤區(qū)，忽略了環(huán)境中共生微生物與靶標菌之間的互作關(guān)系。本研究改變傳統(tǒng)純培養(yǎng)的研究思路，以罹病柑橘寄主植物組織為培養(yǎng)實驗材料，優(yōu)化培養(yǎng)基配方及最適培養(yǎng)條件，將黃龍病菌與其共生菌共培養(yǎng)，憑借高效靈敏的實時熒光定量PCR檢測方法監(jiān)測靶標細菌的種群數(shù)量動態(tài)變化；篩選鑒定對病原菌具有促生作用的伴生微生物，旨在建立一種模擬原

3、生態(tài)的病原細菌和伴生菌的共培養(yǎng)體系，實現(xiàn)病原菌的增殖培養(yǎng)。
　　自廣西、廣東、福建、浙江、湖南等柑橘園采集柑橘黃龍病病樹組織樣品（根系、枝條、葉片和果實）作為供試材料。通過優(yōu)化，確定以黃龍病菌含量最高、其他共生微生物較少的罹病柑橘植株果實橘絡(luò)為培養(yǎng)實驗材料，95％高濃度乙醇表面灼燒消毒法為樣品前處理方法。在前人工作基礎(chǔ)上，經(jīng)過反復(fù)改進，研制出適合柑橘病組織黃龍病菌共培養(yǎng)基（MCLA培養(yǎng)基）配方，配方組分包括QS誘導(dǎo)物、生長因子、抗

4、生物氧毒害劑、殺真菌劑、自然環(huán)境物質(zhì)，以磷酸鹽緩沖液調(diào)整pH為6.4；確定最適培養(yǎng)條件為28℃避光微需氧條件下靜置培養(yǎng)，定期以實時熒光定量PCR方法（Quantitative Real-time PCR，qPCR）對培養(yǎng)的黃龍病菌進行監(jiān)測，了解黃龍病菌增殖情況。
　　經(jīng)表面消毒后，按內(nèi)生細菌分離法進行需氧和微需氧分離培養(yǎng)獲取伴生菌。將所獲伴生菌加入柑橘黃龍病菌培養(yǎng)體系，在兼性厭氧條件下與柑橘黃龍病菌共培養(yǎng)，定期取培養(yǎng)液進行 qPC

5、R檢測，測定柑橘黃龍病菌增殖情況。篩選出對黃龍病菌生長具有促生性伴生菌3株及抑制性伴生菌5株；設(shè)計優(yōu)化的黃龍病菌液體共培養(yǎng)體系能夠使黃龍病菌在液體培養(yǎng)基中穩(wěn)定增殖，經(jīng)實時熒光定量PCR監(jiān)測，黃龍病菌連續(xù)增殖量最高可達50倍，基本實現(xiàn)了黃龍病病原菌與伴生菌的共培養(yǎng)，建成了較穩(wěn)定的共培養(yǎng)體系。
　　黃龍病菌共培養(yǎng)體系的建成不但可以推動黃龍病病原學(xué)、病原生物學(xué)等基礎(chǔ)研究，還有助于黃龍病殺菌劑的研制與開發(fā)、病害早期診斷和治療性抗體研制等應(yīng)