柑橘黃龍病Serralysin蛋白的重組表達(dá)和純化.pdf

1、柑橘黃龍病是世界柑橘生產(chǎn)中最具毀滅性的病害,目前對(duì)柑橘黃龍病的致病機(jī)理還不清楚。對(duì)治病機(jī)理的研究一般著眼于對(duì)治病基因或相關(guān)蛋白的功能分析上,分泌蛋白就是這樣一類(lèi)被人們所關(guān)注的分子。Ⅰ型分泌系統(tǒng)在細(xì)菌中行使蛋白主動(dòng)運(yùn)輸功能,其運(yùn)輸機(jī)制被研究的較為清楚,通過(guò)其分泌進(jìn)攻性的蛋白分子是細(xì)菌作用于寄主的一個(gè)主要途徑。
　　 本研究根據(jù)GenBank上的全基因組序列,設(shè)計(jì)了引物,擴(kuò)增到了柑橘黃龍病中的Ⅰ型分泌蛋白基因(COG2931),并構(gòu)

2、建了它的重組表達(dá)載體,在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá),并對(duì)表達(dá)出的蛋白進(jìn)行了分離和純化。主要獲得了一下結(jié)果:
　　 1.從長(zhǎng)春花感病葉片中提取了黃龍病病原菌的基因組DNA,并用PCR方法和電子顯微鏡觀察的方法進(jìn)行了驗(yàn)證。利用提取的DNA成功擴(kuò)增了柑橘黃龍病中的Serralysin基因,得到的片段長(zhǎng)度為2089bp,經(jīng)測(cè)序和比對(duì),發(fā)現(xiàn)該基因確實(shí)屬于Serralysin家族,并在其序列中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,和3個(gè)串聯(lián)重復(fù)的區(qū)域。
　

3、　 2.我們對(duì)該基因設(shè)計(jì)了基于pET-22b(+)的重組表達(dá)載體,使其與組氨酸標(biāo)簽融合表達(dá),再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的條件進(jìn)行了篩選,得到的最適表達(dá)條件為將菌液在37℃下振蕩培養(yǎng)到OD600～0.6,加入0.4mM的IPTG,然后在28℃下繼續(xù)培養(yǎng)3.5小時(shí)。
　　 3.誘導(dǎo)表達(dá)得到的蛋白進(jìn)行了分離和純化,方法為硫酸沉淀和Ni柱親和層析。最后得到的蛋白純度為99％,蛋白的回收率為1％。