柑橘黃龍病病原菌序列的克隆及系統(tǒng)進化發(fā)育研究.pdf

1、黃龍病是柑橘上的一種毀滅性病害，其病原為革蘭氏陰性細菌，寄生在韌皮部篩管細胞內(nèi)。目前發(fā)現(xiàn)有3個種和黃龍病有關，分別是亞洲種、非洲種和美洲種。柑橘黃龍病病原菌因無法在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，基因組序列信息非常有限。本研究利用基因組步行的方法從亞洲種rplKAJL—rpoBC，16S/23S rRNA，omp基因3個位點上擴增黃龍病亞洲種的核苷酸序列，并根據(jù)亞洲種16S—23S rRNA位點上新序列的保守性設計引物在非洲種和美洲種上擴增，最后根據(jù)3個

2、種在同一位點上序列的保守性設計引物分別對不同地理來源的黃龍病樣品進行測序分析，旨在探討其系統(tǒng)進化發(fā)育關系，從而為以PCR為基礎的黃龍病相關研究提供理論基礎。本研究所獲主要結果如下：
　　 1、在亞洲種3個位點上共獲得了15，168 bp非冗余新序列，其中，在rplKAJL—rpoBC位點上5’端上游區(qū)和3’端下游區(qū)分別獲得了3，218 bp和2，653 bp的非冗余新序列；在16S/23S rRNA位點上5’端上游區(qū)和3’端下游

3、區(qū)分別延伸了1，853 bp和2，459 bp的新序列；在omp基因位點上分別獲得了4，014 bp和971bp的新序列。序列分析表明在rplKAJL—rpoBC位點上的新序列包含2個新基因(suhB和serA)；16S/23S rRNA位點新序列包含4個新基因(膜轉(zhuǎn)運蛋白基因、細胞壁脫氫酶假基因、5S rRNA、tRNAMet)，omp位點新序列包含6個新基因(rpsB、tsf、pyrH、frr、cdsA2、cds2)。
　　

4、 2、在非洲種16S/23S rRNA位點上，獲得了3，057 bp序列包括23S rRNA基因、細胞壁脫氫酶假基因和5S rRNA基因，它們的全長分別是2，205 bp、559 bp和119bp。23S rRNA基因和5S rRNA基因區(qū)間是645 bp。
　　 3、在美洲種16S/23S rRNA位點上，獲得了3，033 bp序列包括23S rRNA基因、glpK基因和5S rRNA基因，它們的全長分別是2，194 bp、4

5、59 bp和121bp。23S rRNA基因和5S rRNA基因區(qū)間是650 bp，反向編碼甘油激酶的細胞壁脫氫酶基因glpK正好位于此區(qū)間內(nèi)。相對于亞洲種，美洲種5S rRNA基因之后有20 bp堿基的缺失。
　　 4、從16S rRNA基因到5S rRNA基因，亞洲種、非洲種和美洲種序列長度分別為5，043 bp、5，037 bp和5，006 bp。這些序列用于同源性分析，結果顯示：亞洲種和非洲種之間的同源性(95.2％)較

6、亞洲種和美洲種的同源性(92.9％)高，非洲種和美洲種之間的同源性(92.6％)與亞洲種和美洲種的同源性較接近(92.9％)。
　　 5、3個病原菌16S/23S rRNA位點上的基因順序分別是亞洲種為16S rRNA、tRNAIIe、tRNAAla、23S rRNA、細胞壁脫氫酶假基因、5S rRNA和tRNAMet；非洲種為16S rRNA、tRNAIIe、tRNAAla、23S rRNA、細胞壁脫氫酶假基因和5S rRNA

7、；美洲種為16S rRNA、tRNAIIe、tRNAAla、23S rRNA、glpK基因和5S rRNA。
　　 6、不同地理來源的黃龍病樣品序列同源性分析結果顯示：來源于巴西圣保羅的樣品與美洲種同源性為99.8％—100％，來源于非洲地區(qū)的樣品與非洲種同源性為99.9—100％，來源于中國廣西、福建、湖南、臺灣和美國佛羅里達州的樣品與亞洲種同源性為99.8％—100％。
　　 7、基于23S—5S位點序列構建的系統(tǒng)發(fā)

8、育樹顯示來源于巴西圣保羅的樣品與美洲種聚為一類，來源于非洲地區(qū)的樣品與非洲種聚為一類，來源于中國廣西、福建、湖南、臺灣和美國佛羅里達州的樣品與亞洲種聚為一類。該結果與不同地理來源的黃龍病樣品序列同源性分析結果一致，說明來源于巴西圣保羅的樣品屬于美洲種類型，來源于非洲地區(qū)的樣品屬于非洲種類型，來源于中國廣西、福建、湖南、臺灣和美國佛羅里達州的樣品屬于亞洲種類型。在這些樣品中，相對于不同的種，同一種類型即種內(nèi)之間的同源性非常高，為99.8％