豬流行性腹瀉病毒變異株與經(jīng)典疫苗株S蛋白免疫原性差異分析.pdf

1、2010年10月以來，豬流行性腹瀉在中國和世界其他主要養(yǎng)豬國家大面積流行。本論文首先對42株P(guān)EDV（2010年以后的PEDV中國流行株24個，美國流行株株7個，韓國毒株6個，參考毒株5個）S蛋白氨基酸序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，與參考毒株相比，2010年以后PEDV流行株的S蛋白的22aa～380aa區(qū)域（命名為SA）為突變的集中區(qū)域;流行株親緣關(guān)系較近且在一個分支，而疫苗株及早期毒株等參考毒株則位于另一個分支;早期毒株與中國現(xiàn)用疫苗毒株

2、CV777之間的同源性較高，為95.0％～99.1％，而2010年后的流行株與參考毒株間的同源性為92.3％～94.1％，其中與疫苗株CV777的同源性僅為93.3％;對SA區(qū)域進(jìn)行抗原位點與糖基化位點的預(yù)測發(fā)現(xiàn)，2010年以后流行株與疫苗株及早期毒株之間在22aa～380aa之間抗原位點差異較大，且在60aa～280aa之間差異最顯著;2010年以后的毒株在62aa～65aa位多出了一個N糖基化位點。以上結(jié)果提示2010年以后的PED

3、V流行株與經(jīng)典毒株相比發(fā)生了明顯變異，在對PEDVS基因進(jìn)行序列分析的基礎(chǔ)上，本論文首先表達(dá)了PEDV中國變異株CH-ZMDZY-11與疫苗株CV777的SA區(qū)域，表達(dá)的SA蛋白具有良好的反應(yīng)原性，為建立檢測抗PEDV抗體的間接ELISA方法、分析PEDV流行株與疫苗株S蛋白免疫反應(yīng)性差異，以及PED亞單位疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。
　　以純化的PEDV中國變異株S蛋白為包被抗原，建立了檢測PEDV流行株抗體的間接ELISA方法。建立的

4、間接ELISA方法最佳反應(yīng)條件為:抗原最適包被量為1ug/孔，包被時間為37℃包被1h后4℃過夜;血清工作濃度為1∶100，作用時間為1.5h;二抗選用HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG稀釋度為1∶4000，作用時間為1.5h;顯色液TMB作用時間為15min;判定標(biāo)準(zhǔn)為，樣品S/P值大于等于0.058判定為陽性，小于0.045判定為陰性。所建ELISA方法具有良好特異性和重復(fù)性。對50份疑似豬流行性腹瀉血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明流行株抗體檢測陽

5、性的樣品均為PEDV流行株抗原陽性。本研究所建立ELISA方法可用于PEDV流行株抗體檢測和疫病監(jiān)測。
　　為分析PEDV流行株和疫苗株S基因差異對疫苗免疫效果影響，本研究將在表達(dá)的PEDV變異株CH/ZMDZY/11與疫苗株CV777 SA蛋白免疫小鼠與成年兔子獲得多克隆抗體，并以SA蛋白為抗原，通過Western bloting及間接ELISA的方法檢測兩種蛋白與多克隆抗體的反應(yīng)性差異，并通過兔抗PEDV SA蛋白多克隆抗體與

6、CV777中和情況比較抗S蛋白抗體中和活性的差異。結(jié)果表明，抗PEDV疫苗株SA蛋白(YSA)多抗與疫苗株SA蛋白的反應(yīng)性明顯高于其與流行株SA蛋白(LSA)的反應(yīng)性;與此相反，抗PEDV流行株SA蛋白多抗與流行株SA蛋白的反應(yīng)性明顯高于其與疫苗株SA蛋白的反應(yīng)性;抗體的中和活性比較顯示，抗PEDV變異株及疫苗株SA蛋白多克隆抗體在中和PEDV疫苗毒CV777上存在很大的差異，即疫苗株的抗體中和CV777效價明顯高于流行株抗體的中和效價